重金屬離子吸附系統及其宿主菌、重金屬離子回收方法與流程

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重金屬離子吸附系統及其宿主菌、重金屬離子回收方法。

背景技術：

近年來，隨著我國經濟建設的迅猛發展，對重金屬的開采、冶煉、加工及商業制造活動日益增多，造成不少重金屬(如鉛、汞、鎘等)進入大氣、水、土壤中，引發了一系列嚴重的污染事件，對生態環境造成了極大的危害。重金屬造成的急性中毒和各類人體慢性疾病如老年癡呆癥，也正在時刻威脅著人類的健康。而另一方面，隨著科技水平的日新月異，那些化學性質穩定、物理屬性優良的重金屬如金、銀、銅、鉑、鈀等，被廣泛應用在了電子、通訊、航空航天、化工、醫療等領域，以及與人們日常生活相關的各類生活日用品中。如何合理地將自然界中的重金屬應用到人類的生產生活中，使之與生態環境保護可持續性和諧發展是目前科技工作者面臨的重大挑戰。一方面，一些重金屬離子在很低濃度時就會對生物體具有極強的毒性，且與有機化合物不同，重金屬具有富集性，在自然環境中很難被降解。由于生產工藝的限制，在一系列生產活動所產生的廢棄物，例如工業廢水中含有大量的重金屬離子，這既會對生態環境造成破壞，也使得生產成本居高不下。目前對于工業廢水中重金屬離子的檢測和富集主要采用的都是物理吸附和化學試劑法，這些方法一般檢測靈敏度較低，尤其是對各種性質相近的重金屬離子的區分度較差，無法實現對某種特定重金屬離子的特異識別與去除。而采用大型分析設備如icp-ms(電感耦合等離子體質譜)，雖然其對重金屬離子的檢測靈敏度更高，但是操作手段繁瑣，耗時較長，必須要將樣品送到指定部門由專業人員進行檢測，難以實現現場的快速檢驗和實時監測，且在檢測的基礎之上再利用這些大型儀器實現重金屬的特異吸附就更加困難。

綜上，現有的重金屬離子回收的化學方法有三個缺點：第一是化學方法有可能由于加入的化學試劑的量不合適而造成二次污染；第二是化學方法選擇性不夠高，尤其是處理性質極相近的各種重金屬離子效果不好，即使回收得到了一定的目的金屬，純度也不高，還需要進一步處理；第三是化學方法回收工業廢水中的重金屬離子時所產生的污水對于環境不友好，沉淀劑等化學試劑可能對于自然環境造成更大的破壞。鉛、金與鈾酰是重金屬中少有的化學、物理、電子性能優異的重金屬，應用領域非常廣，但是現有的方法很難實現對工業廢水中重金屬離子的高效選擇性富集和回收。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種重金屬離子吸附系統及其宿主菌、重金屬離子回收方法，旨在解決現有重金屬離子回收選擇性不強、純度低、效果不理想，以及污染環境的技術問題。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一方面，本發明提供一種重金屬離子吸附系統，包括相互連接的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和重金屬離子結合蛋白dna序列，且所述枯草芽孢桿菌芽生物膜蛋白tasadna序列與啟動子連接。。

另一方面，本發明提供一種重金屬離子吸附蛋白表面展示系統，包括由上述重金屬離子吸附系統表達的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和重金屬離子結合蛋白。

另一方面，本發明提供一種表達載體，包括上述重金屬離子吸附系統。

又一方面，本發明提供一種宿主菌，所述宿主菌包括上述表達載體；或所述宿主菌表達上述重金屬離子吸附蛋白表面展示系統。

再一方面，本發明提供一種上述重金屬離子吸附系統的制備方法，包括如下步驟：

從枯草芽孢桿菌基因組中擴增出枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列；

從表達重金屬離子結合蛋白的菌種基因組中擴增出所述重金屬離子結合蛋白dna序列；

將啟動子、所述枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和所述重金屬離子結合蛋白dna序列依次連接。

最后，本發明提供一種重金屬離子回收方法，包括如下步驟：

提供含有重金屬離子的液體；

將本發明的宿主菌培養后加入所述液體中，靜置處理；

待所述溶液中出現沉淀后，進行過濾處理得到吸附有重金屬離子的所述宿主菌；

用酸處理吸附有重金屬離子的所述宿主菌，分離后得到重金屬離子。

本發明的重金屬離子吸附系統高選擇性吸附重金屬離子，其根據鼠傷寒沙門氏菌中重金屬離子的調控機制設計，其中包含了該菌調控機制中關鍵部分。本發明的重金屬離子吸附系統包括枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和重金屬離子結合蛋白的dna序列以及調控其表達的啟動子，而且其容易制備、成本較低、操作方便。將該系統連接到質粒中后導入非致病性的枯草芽孢桿菌細胞體內，在啟動子調控下使得吸附部分的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和重金屬離子結合蛋白大量表達，可高效選擇性吸附重金屬離子。可以表達重金屬離子吸附蛋白表面展示系統的工程菌，對重金屬離子的吸附及回收具有很好的效果。

本發明提供的重金屬回收方法，利用可表達重金屬離子吸附蛋白表面展示系統的工程菌高效吸附回收重金屬離子，將工程菌液加入到含重金屬離子的廢水中，菌體能夠在細胞膜外大量表達重金屬離子結合蛋白，將廢水中的重金屬離子結合，其選擇性強、獲得的純度高；在完成重金屬離子結合吸附后，對菌體進行聚集和沉淀，菌體回收方便，可二次使用。本發明最終能夠通過生物手段實現對工業廢水中重金屬離子的可循環富集和回收；因此，其夠克服現有技術的缺點，不會造成二次污染，對環境友好。

附圖說明

圖1是本發明實施例1重金屬離子檢測系統質粒構建圖譜；

圖2是本發明實施例1重金屬離子檢測系統質粒的電泳鑒定圖；其中，m是dna分子量標準，1是重金屬離子檢測系統質粒泳道；

圖3是本發明實施例2重金屬離子吸附系統質粒構建圖譜；

圖4是本發明實施例2重金屬離子吸附系統質粒的電泳鑒定圖；其中，m是dna分子量標準，1是融合蛋白表達tasa-golb/pbrr/sup質粒泳道；

圖5是本發明實施例3重金屬離子吸附系統表達時使用的pdg1730質粒載體圖譜；

圖6是本發明實施例6重金屬離子吸附系統對金離子吸附效果對比圖；

圖7是本發明實施例6重金屬離子吸附系統對鈾酰離子吸附效果對比圖；

圖8是本發明實施例6重金屬離子吸附系統對鉛離子吸附效果對比圖。

具體實施方式

為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖和實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

一方面，本發明實施例提供了一種重金屬離子吸附系統，包括相互連接的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和重金屬離子結合蛋白dna序列，且該枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列與啟動子連接。

在一實施例中，該啟動子為pcot，其序列如seqidno:18所示；或者該啟動子也可以為pveg，其序列如seqidno:21所示。而枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列如seqidno:3所示。

進一步地，重金屬離子結合蛋白dna序列的下游連接有綠色熒光蛋白egfpdna序列，如seqidno:15所示。如此，可以進一步檢測到重金屬離子吸附系統的表達。

又一實施例中，該重金屬離子結合蛋白dna序列為鉛離子結合蛋白pbrrdna序列，其如seqidno:6所示；或重金屬離子結合蛋白dna序列為金離子結合蛋白golbdna序列，其如seqidno:9所示；或重金屬離子結合蛋白dna序列為鈾酰離子結合蛋白supdna序列，其如seqidno:12所示。凡是可以與重金屬離子結合的功能蛋白dna序列，都是本發明實施例中金屬離子結合蛋白dna序列，這里不一一列舉。

另一方面，本發明實施例提供一種重金屬離子吸附蛋白表面展示系統，其包括由本發明實施例的重金屬離子吸附系統表達的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和金離子結合蛋白golb。

另一方面，本發明實施例提供了一種表達載體，該表達載體包括本實施例的重金屬離子吸附系統。同時，本發明實施例提供了一種宿主菌，該宿主菌包括本實施例的表達載體；或表達本實施例的重金屬離子吸附蛋白表面展示系統。

又一方面，本發明實施例提供一種上述重金屬離子吸附系統的制備方法，包括如下步驟：

s011：從枯草芽孢桿菌基因組中擴增出枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列；

s012：從表達重金屬離子結合蛋白的菌種基因組中擴增出該重金屬離子結合蛋白dna序列；

s013：將啟動子、枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和重金屬離子結合蛋白dna序列依次連接。

在一實施例中，擴增所述枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列的引物如seqidno:1、seqidno:2所示；又一實施例中，該啟動子可以為pcot或pveg，且擴增pcot的引物如seqidno:16、seqidno:17所示，擴增pveg的引物如seqidno:19、seqidno:20所示，該兩啟動子都可從本實驗室枯草芽孢桿菌基因組中擴增出；又一實施例中，重金屬離子結合蛋白dna序列為鉛離子結合蛋白pbrrdna序列或金離子結合蛋白golbdna序列或鈾酰離子結合蛋白supdna序列，且擴增該鉛離子結合蛋白pbrrdna序列的引物如dnaseqidno:4、seqidno:5所示，擴增該金離子結合蛋白golbdna序列的引物如dnaseqidno:7、seqidno:8所示，擴增該鈾酰離子結合蛋白supdna序列的引物拉如seqidno:10、seqidno:11所示。本實施例中，可從鼠傷寒沙門氏菌基因組(ncbi中的引用位置：nc_003197)與嗜銅桿菌基因組(ncbi中的引用位置：nc_007973)中分別擴增出金離子結合蛋白golbdna序列和鉛離子結合蛋白pbrrdna序列；而鈾酰離子結合蛋白supdna序列可人工合成，效果更好。

最后，本發明實施例還提供了一種重金屬離子回收方法，其包括如下步驟：

s021：提供含有重金屬離子的液體；

s022：將本發明實施例的宿主菌培養后加入上述液體中，靜置處理；

s023：待溶液中出現沉淀后，進行過濾處理得到吸附有重金屬離子的宿主菌；

s024：用酸處理吸附有重金屬離子的宿主菌，分離后得到重金屬離子。

在一選實施例中，上述步驟s021中，含有重金屬離子的液體可以是各種工業廢水、礦業廢水等中含有重金屬離子的回收液，在該液體中重金屬離子的濃度范圍優選為0.1μm～20μm；上述步驟s022中，靜置處理的時間范圍為40h～48h，該范圍內宿主菌對液體中重金屬離子起到很好的吸附效果。

本發明先后進行過多次試驗，現舉一部分試驗結果作為參考對發明進行進一步詳細描述，下面結合具體實施例進行詳細說明。

實施例1重金屬離子檢測系統表達質粒的構建及鑒定

1.檢測系統中重金屬離子結合蛋白基因片段的擴增

使用特異引物(seqidno:4)(seqidno:5)(seqidno:7)(seqidno:8)從嗜銅桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_007973)與鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴增出編碼重金屬離子結合蛋白基因的dna序列(seqidno:6)(seqidno:9)，人工合成的sup基因的dna序列(seqidno:12)，并設計對應的擴增引物(seqidno:10)(seqidno:11)，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，3分鐘

第二步：95℃，1分鐘

第三步：60℃，2分鐘

第四步：72℃，4分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產物，備用。

2.枯草芽孢桿菌生物膜蛋白(tasa)片段的基因擴增

根據所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設計特異引物tasa1(seqidno:1)和tasa2(seqidno:2)，從枯草芽孢桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_000964)中擴增出編碼枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa第1位至第314位dna的堿基序列(seqidno:3)，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產物，備用。

3.檢測系統中報告基因egfp-terminator片段的擴增

1)綠色熒光蛋白egfp片段基因的擴增

使用特異引物(seqidno:13)(seqidno:14)從本實驗室所有的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出編碼綠色熒光蛋白egfp的dna序列(seqidno:15)，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產物，備用。

2)終止子terminator片段的基因擴增

根據所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設計特異引物term1(seqidno:22)和term2(seqidno:23)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:24)，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr反應條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產物，備用。

3)egfp-terminator片段的基因擴增

根據所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，使用特異引物(seqidno:13)(seqidno:23),以上述第1和2點回收的擴增產物為模版，擴增出egfp-terminator片段的dna序列，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr反應條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：65℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產物，備用。

4.檢測系統中重金屬離子表面展示和報告基因融合蛋白表達質粒的構建與鑒定

1)使用dna限制性內切酶ecori和psti酶切上述tasa基因的dna片段，然后使用t4dna連接酶插入到本實驗室所有的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中。

酶切反應體系(20μl)：

反應條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應體系(10μl，100ngdna)：

反應條件：16℃水浴16小時。

2)使用dna限制性內切酶xbai和psti酶切上述得到的三個重金屬離子吸附蛋白的dna片段(pbrr,golb與sup)然后使用t4dna連接酶插入1)步驟構建完成的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中。

酶切反應體系(20μl)：

反應條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應體系(10μl，100ngdna)

反應條件：16℃水浴16小時。

3)最后使用dna限制性內切酶xbai和psti酶切上述egfp-terminator片段，然后使用t4dna連接酶插入2)步驟構建完成的大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中，得到重金屬離子檢測系統表達質粒見圖1，電泳鑒定結果請見圖2。

實施例2重金屬離子吸附系統表達質粒的構建及鑒定

1.吸附系統中專用啟動子片段ptas與pveg的擴增

根據所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設計特異引物(seqidno:16)(seqidno:17)或(seqidno:19)(seqidno:20)，從本實驗室枯草芽孢桿菌基因組中擴增出重金屬離子調控基因的啟動子的ptas序列(seqidno:18)或pveg序列(seqidno:21)，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產物，備用。

2.吸附系統中重金屬離子吸附基因片段的擴增

1)枯草芽孢桿菌生物膜蛋白(tasa)片段的基因擴增

根據所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設計特異引物tasa1(seqidno:1)和tasa2(seqidno:2)，從枯草芽孢桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_000964)中擴增出編碼枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa第1位至第314位dna的堿基序列(seqidno:3)，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產物，備用。

2)重金屬離子結合蛋白片段的基因擴增

見實施例1。

3)終止子terminator片段的基因擴增

根據所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設計特異引物term1(seqidno:22)和term2(seqidno:23)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:24)，反應條件如下。

pcr反應體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復第二步至第四步，29個循環

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產物，備用。

3.tasa-golb融合蛋白表達質粒的構建及鑒定

1)使用dna限制性內切酶xbai和psti酶解上述tasa和三種重金屬離子結合蛋白的dna片段，然后使用t4dna連接酶插入大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中，tasa-pbrr/golb/sup融合蛋白表達質粒構建圖譜請詳見圖3，鑒定結果見圖4。

酶切反應體系(20μl)

反應條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應體系(10μl(100ngdna)：

反應條件：16℃水浴16小時。

實施例3重金屬離子吸附系統同源重組表達質粒的構建及鑒定

1.使用dna限制性內切酶psti和spei酶解上述得到的啟動子pcot/pveg片段，使用dna限制性內切酶psti和xbai酶解上述tasa-pbrr/golb/sup的dna片段，然后使用t4dna連接酶插入到大腸桿菌生物磚質粒骨架pzh2中，將大腸桿菌生物磚表達載體pzh2中的目的片段使用dna限制性內切酶psti和ecori酶切下來整合到pdg1730枯草芽孢桿菌表達載體(見圖5)，同源重組到枯草芽孢桿菌的基因組上進行表達，即獲得所述的重金屬離子吸附系統。

酶切反應體系(20μl)：

反應條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應體系(10μl，100ngdna)：

反應條件：16℃水浴16小時。

實施例4重金屬離子吸附系統質粒轉入宿主菌

1)將上述同源重組所得的表達型質粒載體用cacl2轉化法轉化大腸桿菌dh5α，酶切鑒定重組整合載體。

2)枯草芽胞桿菌的轉化，活化枯草芽胞桿菌轉接到spi培養基中培養一段時間，然后轉到spⅱ培養基中培養形成感受態，將重組pdg1730質粒切成線狀轉化枯草芽胞桿菌，具體方法參照zeigler(2002)。

3)重組菌的篩選和鑒定

采用常規菌落pcr法和抽提陽性克隆的質粒后酶切鑒定法，具體可參見《takara限制性內切酶采購目錄和技術指南》。測序由上海生物工程技術服務公司完成。重金屬離子吸附及回收系統質粒的提取與鑒定。

實施例5重金屬離子吸附系統對重金屬離子選擇性能力的檢測

1.將用于檢測重金屬離子的枯草芽孢桿菌菌種接入適量含有壯觀霉素(50μgml^-1)的lb液體培養基中于37℃中培養過夜；將過夜培養菌液1:100稀釋入適量含有壯觀霉素(50μgml^-1)dsm液體培養基中于37℃中培養至培養液od600＝0.6，向培養液中分別加入終濃度為20μm的銀、鎳、鋅、銅、鎘、鉻、鉛離子，培養液在37℃中繼續培養48h；

2.培養48h的細菌培養液通過離心(8000轉/分鐘，2min)收集后，用去離子水清洗1次；

3.清洗后的菌體使用1×pbs緩沖液重懸；

4.使用酶標儀檢測重懸后的菌液。

檢測結果顯示：經改造的工程菌對相對應的重金屬離子有較好的選擇性。

實施例6tasa-pbrr/golb/sup、wt168重金屬離子吸附能力的檢測

對工程菌tasa-pbrr/golb/sup(對應連接兩種不同的啟動子：pcot或pveg)以及wt168(枯草芽孢桿菌常用品系，此處為對照組)進行吸附實驗，檢測重金屬離子吸附能力。實驗前兩種菌均劃線培養于lb固體培養基中(壯觀霉素抗性)。

①從兩個個培養皿中分別挑取單菌落接種于5mllb(含5ul壯觀霉素)培養基中，37℃、220rpm培養過夜。

②將細菌培養液以1：100重新接種于100mllb(含100ul氨芐青霉素)培養基中，37℃、220rpm培養至od600＝0.6，加入重金屬離子濃度終濃度分別為1μmol，5μmol，20μmol。37℃、220rpm繼續培養48h。每個實驗組設置3個重復。

③收集細菌，棄上清液。ddh2o清洗3次。-80℃凍存6h后用凍干機凍干細菌沉淀。

④稱重后用1ml濃硝酸消解至完全，用雙蒸水定容至10ml，最后使用電感耦合等離子發射光譜(icp-aes)檢測。

在重金屬離子濃度為20μmol時，其吸附檢測結果如圖6、圖7和圖8所示：圖6為兩種工程菌(pcot/pveg-tasa-golb)相對對照組對金離子吸附效果圖，圖7為兩種工程菌(pcot/pveg-tasa-sup)相對對照組對鈾酰離子吸附效果圖，圖8為兩種工程菌(pcot/pveg-tasa-pbrr)相對對照組對鉛離子的吸附效果圖。檢測結果顯示：經改造的工程菌對相對應的重金屬離子有更好的吸附性。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>深圳勁宇生物科技有限公司

<120>重金屬離子吸附系統及其宿主菌、重金屬離子回收方法

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<213>擴增編碼枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa的基因的引物

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<210>7

<211>45

<212>dna

<213>擴增編碼金離子結合蛋白golb的基因的引物

<400>7

ctttcttcgaattcgcggcccttctagagaatgcagttccatatt45

<210>8

<211>63

<212>dna

<213>擴增編碼金離子結合蛋白golb的基因的引物

<400>8

gtttcttcctgcagcggccgtactagtataaaggatgacgacgataagatctgaaagctt60

ggg63

<210>9

<211>228

<212>dna

<213>金離子結合蛋白golb的dna序列

<400>9

atgcagttccatattgatgacatgacctgcggcggctgcgccagtacggtaaaaaagacg60

attctgactctcgatgctaatgcgacggtgagaactgacccggcgacgcgtctggttgac120

gttgaaacgtcgctatccgcggagcagattgccgccgccctgcaaaaggccggtttcccg180

ccgcgcgagaggctcgaggattacaaggatgacgacgataagatctga228

<210>10

<211>46

<212>dna

<213>擴增編碼鈾酰離子結合蛋白sup的基因的引物

<400>10

ctttcttcgaattcgcggcccttctagagagtttcttcctgcagcg46

<210>11

<211>64

<212>dna

<213>擴增編碼鈾酰離子結合蛋白sup的基因的引物

<400>11

gtttcttcctgcagcggccgtactagtataaaggatgaccttcgataatgcggtgcagcatacg64

<210>12

<211>267

<212>dna

<213>鈾酰離子結合蛋白sup的dna序列

<400>12

ggcggaggttctggaggagggagcaatgccctggattgccgtgaacgcattgaaaaagac60

ctggaaaacctggaaaaagaactgatggaaatgaaaagcatcaaactgtctgatgacgaa120

gaagcggtggttgaacgtgccctgaattatcgcgatgacagtgtctattacctggaaaaa180

ggcgatcatattacctcctttggttgtatcacgtacgcggagggcctgacggatagcctg240

cgtatgctgcaccgcattatcgaaggt267

<210>13

<211>50

<212>dna

<213>擴增編碼綠色熒光蛋白egfp的基因的引物

<400>13

ctttcttcgaattcgcggccatatacatatgagtaaaggagaagaacttt50

<210>14

<211>42

<212>dna

<213>擴增編碼綠色熒光蛋白egfp的基因的引物

<400>14

ttagtggccgtatgttggccgtactagtaattaagcaccggt42

<210>15

<211>797

<212>dna

<213>綠色熒光蛋白egfp的dna序列

<400>15

atatacatatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaat60

tagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaa120

catacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggc180

caacacttgtcactactttgacttatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcata240

tgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcacta300

tatttttcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgata360

cccttgttaatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcg420

gacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaa480

agaatggaatcaaagttaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaac540

tagcagaccattatcaacaaaatactccaaaccattacctgtcgacacaatctgcccttt600

cgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggcatggatgagctctacaaatatcgata660

tgaattccaactgagcgccgctagcaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccacca720

accattacctgtcgacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccaca780

caacatacggccactaa797

<210>16

<211>43

<212>dna

<213>擴增啟動子ptas的引物

<400>16

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagcggcttcagttgt43

<210>17

<211>37

<212>dna

<213>擴增啟動子ptas的引物

<400>17

gtttcttcctgcagcggccgtactagtaaaggtaagc37

<210>18

<211>63

<212>dna

<213>啟動子ptas的序列

<400>18

cttcagttgtaaacctggcaacaggtttcgatataaaatcattcaataaaaggggagctt60

acc63

<210>19

<211>43

<212>dna

<213>擴增啟動子pveg的引物

<400>19

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagaattttgtcaaaa43

<210>20

<211>36

<212>dna

<213>擴增啟動子pveg的引物

<400>20

gtttcttcctgcagcggccacatttattgtacaaca36

<210>21

<211>97

<212>dna

<213>啟動子pveg的序列

<400>21

aattttgtcaaaataattttattgacaacgtcttattaacgttgatataatttaaatttt60

atttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgt97

<210>22

<211>43

<212>dna

<213>擴增終止子terminator的引物

<400>22

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagcggcggcatggac43

<210>23

<211>37

<212>dna

<213>擴增終止子terminator的引物

<400>23

gtttcttcctgcagcggccgtactagtaaaaggccca37

<210>24

<211>171

<212>dna

<213>終止子terminator的序列

<400>24

accggcggcatggacgagctgtacaagtaataatactagagccaggcatcaaataaaacg60

aaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctct120

ctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatat171