本發明屬于分子生物學領域，涉及一種利用pcr擴增檢測結合耐高溫限制性內切酶處理檢測血漿游離dna中kras基因突變的試劑盒及方法。
背景技術：
：k-ras基因最早發現與上世紀八十年代初，首先從人膀胱癌細胞系中分離出一種轉化基因，可使nih3t3細胞發生惡性轉化，而從正常人組織中提取的dna則無此種作用。k-ras基因家族與人類腫瘤相關的基因有三種——h-ras、k-ras和n-ras，分別定位在11、12和1號染色體上。k-ras基因就像體內一個“開關”，它在腫瘤細胞生長以及血管生成等過程的信號傳導通路中起著重要調控作用，正常的k-ras基因可抑制腫瘤細胞生長，而一旦發生突變，它就會持續刺激細胞生長，打亂生長規律，從而導致腫瘤的發生。在不同的癌癥當中存在不同的kras突變的比例：胰腺癌(90％)、結腸癌(50％)、肺癌(30％)、卵巢癌(15％)、甲狀腺癌(50％)、膀胱癌(6％)，紅斑性狼瘡(sle)、乳腺癌、肝癌、皮膚癌、類風濕性關節炎(ra)、腎癌及某些的白血病(leukemia)都有較高的突變水平。及時的檢測kras意義很大，檢測k-ras基因突變是深入了解癌基因的情況、了解各種癌癥的發展預后、放化療療效的重要指標。(1)k-ras基因突變發生在腫瘤惡變的早期，并且原發灶和轉移灶的k-ras基因高度保持一致。一般認為，k-ras基因狀態不會因治療而發生變化。(2)k-ras基因突變見于20％的非小細胞肺癌(nsclc)，其中肺腺癌占30％～50％。循環腫瘤dna(ctdna)突變檢測是近年來興起且發展迅速的腫瘤診斷技術，稱為“液體活檢”。ctdna是指腫瘤細胞體細胞dna經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統；隨著基因測序的飛速發展，目前，已能在血液中對其進行檢測并計數。ctdna來自腫瘤細胞的體細胞突變，不同于遺傳突變的是其存在于體內每個細胞。因此，ctdna是一種特征性的腫瘤生物標記物，并且還可以被定性、定量和追蹤。與組織活檢相比ctdna檢查微創小、無放射性污染、經濟、新dna無防腐劑污染等優點，并允許對治療反應實時監測。由于ctdna含量低(<1.0％總cfdna)，片段短(180-200bp)，半衰期短(～2小時)，故其檢測對痕量核酸檢測技術提出全新的挑戰。目前具備極微量核酸基因突變檢測能力的技術主要有arms技術(包括super-arms)、第二代測序(ngs)和數字pcr(ddpcr，包括beaming技術)等。ngs技術可檢測未知突變且檢測基因數量不受限，在腫瘤耐藥突變的監測與研究等領域有很大的應用潛力。然而，ngs建庫技術復雜，常規建庫測序方法使得血漿中含量極低的腫瘤信號完全淹沒在背景噪聲中，建庫過程原始信息丟失嚴重或成為敏感度潛力發揮的限制因素。數字pcr技術，具有極高的敏感性，可絕對定量，但該方法檢測通量較低。由于，ctdna含量極少，且腫瘤dna分子存在的數量遠遠不及正常細胞的dna，腫瘤相關dna被來自正常細胞dna嚴重稀釋，單分子豐度僅0.01％，化驗結果特別容易被干擾。因此，能夠特異性的豐富樣品靶序列的富集技術是液體活檢技術發展的關鍵。技術實現要素：本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種基于富集技術的循環腫瘤dna(ctdna)k-ras基因c.35g>a、c.35g>t、c.35g>c突變的檢測試劑盒及方法。通過靶向富集血漿游離dna中k-ras基因c.35g>a、c.35g>t、c.35g>c突變基因片段，提高該突變的檢測靈敏度。為達到上述發明目的，本發明的技術方案為：所述檢測血漿游離dna中k-ras基因突變的試劑盒中含有特異性引物對和耐高溫的限制性內切酶；所述特異性引物包括序列如seqidno.1(agacatcgtaggtagtgacaaagctttgactgcatacaaacttgtggtagttggac)所示的正義引物和序列如seqidno.2(caatatgttcctgcggtaaagcgtcaggatccttagaccatattcgtccaca)所示的反義引物；所述耐高溫的限制性內切酶bsrⅰ內切酶。所述試劑盒中還含有高保真dna聚合酶和pcr常規組件。優選地，所述高保真dna聚合酶為hotstartaqplusdna聚合酶。所述pcr常規組件包括dntp混合液、含鎂離子的pcr反應緩沖液、去離子水。基于試劑盒檢測血漿游離dna中pik3ca基因突變的方法包括如下步驟：(1)按照血漿游離dna常規提取方法提取血漿游離dna；(2)采用本發明所述試劑盒進行pcr反應；(3)將步驟(2)獲得的pcr產物送去一代測序，并通過與genebank中記錄的序列做blast一致性分析，判斷突變情況。即，利用sanger測序法分析pcr產物中是否有突變存在。其中，步驟(2)所述進行pcr反應的具體過程分為三步：a)采用試劑盒中的特異性引物對、高保真dna聚合酶、pcr常規組件構成的pcr反應體系，進行pcr反應；b)在pcr反應過程中加入試劑盒中的耐高溫的限制性內切酶，并于65℃酶切反應1h；c)酶切反應結束后繼續進行pcr反應。優選地，步驟a中所述pcr反應的條件為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles。步驟c中所述pcr反應的條件為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃終延伸5min。下面對本發明作進一步說明：利用本發明所述試劑盒檢測時，pcr反應共分三步進行：①配置不含限制性內切酶bsrⅰ的pcr反應體系(25μl)，以步驟(1)獲得的血漿游離dna為模板，進行pcr擴增；pcr反應的條件如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec(15cycles)；②在步驟①反應結束后，往pcr反應體系中加入0.8μl限制性內切酶bsrⅰ；65℃反應1小時；③在步驟②反應結束后，接著進行pcr反應；95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃終延伸5min。步驟①中，每25μlpcr反應體系中的組分如下：正義引物0.4μl，反義引物0.4μl，模板dna2μl，10×pcrbuffer(含硫酸鎂)2.5μl，dntp混合液(每種10mm)0.5μl，hotstartaqplusdna聚合酶0.3μl，余量為去離子水；步驟②中所使用的限制性內切酶bsrⅰ是耐高溫的，在pcr反應用不會出現熱失活，且其特異性識別序列為5’-actggn-3’(n＝aortorcorg)，正好能識別k-ras基因c.35位密碼子的區域，當kras基因c.35位密碼子為野生型(g)時，bsrⅰ酶可將dna雙鏈切斷；當c.35位密碼子出現g>a、g>t、g>c突變時，由于內切酶嚴格的序列特異性，bsrⅰ酶將不c.35能識別該序列，不能將dna雙鏈切斷。本發明利用耐高溫的限制性內切酶(bsrⅰ)，bsrⅰ內切酶能特異性識別kras基因c.35位密碼子的野生型序列，并將其dna雙鏈切斷；而當c.35位密碼子出現g>a、g>t、g>c突變時，bsrⅰ將不能識別該序列，不能將dna雙鏈切斷。通過在普通的pcr反應中，加入耐高溫的限制性內切酶，可在反應過程中將野生型的dna片段破壞，使得野生型的pcr產物越來越少，而突變型的dna片段能在反應中不斷的富集，提高了低豐度突變的檢測靈敏性。總之，采用本發明所述檢測kras基因突變的試劑盒和檢測方法檢測kras基因突變，可提高突變檢測的靈敏度，減少樣本使用量，有利用臨床使用和推廣。具體實施方式kras基因c.35g>a、c.35g>t、c.35g>c突變基因型轉化(1)在樣品模板中采用pcr方法擴增c.35突變位點待識別片段，引物如下：kras-f：5’-agacatcgtaggtagtgacaaagctttgactgcatacaaacttgtggtagttggac-3’(seqidno.1)kras-r：5’-caatatgttcctgcggtaaagcgtcaggatccttagaccatattcgtccaca-3’(seqidno.2)。(2)限制性內切酶bsrⅰ識別位點pcr反應條件：1)pcr體系如表1：表1hotstartaqplusdna0.3μl10xpcrbuffer2.5μldntp(各10mm)0.5μl上游引物(10μm)0.4μl下游引物(10μm)0.4μldna模板2μlddh2oupto25μl反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles；2)在pcr反應體系中加入限制性內切酶bsrⅰ0.8μl,65℃1小時3)95℃預變性5min；95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃終延伸5分鐘。(3)pcr產物送去一代測序，測序結果與genebank中記錄的序列做blast一致性分析。結果顯示，當野生型模板與突變型模板的比例為10000:1的情況下，測序結果依然能夠在kras基因c.35位置處出現一個套峰，結果顯示該方法能夠在大量野生型模板的干擾下成功擴增出微量豐度的突變型模板。sequencelisting<110>郴州市第一人民醫院<120>一種檢測血漿游離dna中kras基因突變的試劑盒及方法<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>56<212>dna<213>人工合成<400>1agacatcgtaggtagtgacaaagctttgactgcatacaaacttgtggtagttggac56<210>2<211>52<212>dna<213>人工合成<400>2caatatgttcctgcggtaaagcgtcaggatccttagaccatattcgtccaca52當前第1頁12