本發明屬于植物化學技術領域，具體涉及一種分離自藍花黃芩的新型克羅烷型二萜類化合物及其在制備抗hiv藥物中的用途。
背景技術：
唇形科(lamiaceae)黃芩屬(scutellaria)植物廣泛分布于熱帶和亞熱帶山脈地區，遍及歐洲、北美和東亞，約有360多個物種。在我國明確記載的有102種，50個變種，多為藥用。其中2010年版《中國藥典》收錄2種：黃芩(scutellariabaicalensis)和半枝蓮(scutellariabarbata)，黃芩主治濕溫、暑濕，胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩咳，血熱吐衄，癰腫瘡毒和胎動不安。現代藥理研究表明，黃芩屬植物具有抗氧化、抗腫瘤、保肝，抗炎、抗驚厥、抗菌、抗病毒等作用。萜類和酚類化合物是黃芩屬植物的主要化學成分，其中二萜類具有很好的抑制ebv病毒裂解復制，抗腫瘤，抗拒食和對脂多糖誘導的一氧化氮生成起抑制作用等活性。
藍花黃芩(scutellariaformosanan.e.brown)為番唇形科(lamiacea)黃芩屬多年生草本植物，根莖近木質，具纖維狀須根。該植物產自廣東，江西，福建，云南等地。目前關于藍花黃芩的化學成分及藥理活性的研究僅限于揮發油成分鑒定及其粗提物活性研究，結果表明藍花黃芩粗提物具有一定的抗腫瘤和抗hiv-1活性。據本屬植物相關報道，這些活性可能與二萜類成分有關。從藍花黃芩分離得到的新克羅烷型二萜類化合物未見報道，也未見該類化合物在抗hiv-1報道。
技術實現要素：
本發明提供一種新克羅烷型二萜類化合物、其立體異構體、互變異構體、前藥或其藥學上可接受的鹽，其特征在于所述新克羅烷型二萜類化合物具有式i所示的結構：
本發明提供另一優選實施方案，式i化合物優選如下化合物ii-viii：
本發明的另一實施方案提供一種同時制備化合物ii-viii的方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)將陰干的藍花黃芩全草粉碎，用乙醇溶液加熱50-60℃提取2-4次，每次提取1-3h，合并提取液，減壓濃縮得粗提物；
(2)將步驟(1)得到的粗提物用適量的水稀釋制成懸浮液后，依次用等體積的石油醚萃取3-5次，合并石油醚相，減壓濃縮得浸膏；
(3)將步驟(2)得到的浸膏，先經減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每個梯度收集兩個柱體積，根據極性大小分成10個組分，其中梯度100:0～90:10洗脫得到的為組分1，梯度90:10～80:20洗脫得到的為組分2，梯度80:20～70:30洗脫得到的為組分3，梯度70:30～60:40洗脫得到的為組分4，梯度60:40～50:50洗脫得到的為組分5，梯度50:50～40:60洗脫得到的為組分6，梯度40:60～30:70洗脫得到的為組分7，梯度30:70～20:80洗脫得到的為組分8，梯度20:80～10:90洗脫得到的為組分9，梯度10:90～0:100洗脫得到的為組分10，其中組分4先經正相硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶劑，洗脫2-5個柱體積，減壓濃縮后再經sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為chcl3:meoh＝1:1的混合溶劑，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝55:45，依次得到化合物ii、iv、vi，組分5先經sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為meoh，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝75:25，依次得到化合物iii、viii，組分6經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為mecn:h2o＝75:25，依次得到化合物vii、v。
上述制備方法，步驟(1)中所述乙醇溶液為體積分數為75-95％的乙醇溶液，其用量為每千克藍花黃芩全草(干重)用2-3l乙醇溶液。步驟(2)中水的用量，本領域的技術人員可以根據粗提物的量，合理選擇水的用量，優選每100克粗提物加水200-300ml，每次萃取石油醚的體積用量與水的體積相同。
本發明色譜分離中所有涉及洗脫劑或流動相比例均為體積比。
本發明的另一實施方案提供一種抗hiv藥物，其特征在于該藥物以式i化合物、其立體異構體、互變異構體、前藥或其藥學上可接受的鹽作為有效成分。該藥物還可包括其他抗病毒藥物。該藥物還可包括藥用輔料，例如藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
本發明的另一實施方案提供一種抗hiv藥物，其特征在于該藥物以化合物ii-viii、其立體異構體、互變異構體、前藥或其藥學上可接受的鹽作為有效成分。該藥物還可包括其他抗病毒藥物。該藥物還可包括藥用輔料，例如藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
本發明的另一實施方案提供式i化合物、其立體異構體、互變異構體、前藥或其藥學上可接受的鹽在制備抗hiv藥物中的用途。尤其是在制備抗hiv-1藥物中的用途。
本發明的另一實施方案提供化合物ii-viii、其立體異構體、互變異構體、前藥或其藥學上可接受的鹽在制備抗hiv藥物中的用途。尤其是在制備抗hiv-1藥物中的用途。
本發明中術語“藥學上可接受的鹽”是指非毒性的無機或有機酸和/或堿的加成鹽，可參見“saltselectionforbasicdrugs”,int.j.pharm.(1986),33,201–217。
具體實施方式
為了便于對本發明的進一步理解，下面提供的實施例對其做了更詳細的說明。但是這些實施例僅供更好的理解發明而并非用來限定本發明的范圍或實施原則，本發明的實施方式不限于以下內容。
實施例1：克羅烷型二萜類化合物ii-viii的制備
(1)將陰干的藍花黃芩全草(2.0kg)粉碎，用75％的乙醇溶液(6l)加熱50-60℃提取4次，每次提取1h，合并提取液，減壓濃縮得粗提物(約300g)；
(2)將步驟(1)得到的粗提物用適量的水(600ml)稀釋制成懸浮液后，依次用等體積的石油醚(600ml)萃取5次，合并石油醚相，減壓濃縮得浸膏(約21g)；
(3)將步驟(2)得到的浸膏，先經減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每個梯度收集兩個柱體積，根據極性大小分成10個組分，其中梯度100:0～90:10洗脫得到的為組分1，梯度90:10～80:20洗脫得到的為組分2，梯度80:20～70:30洗脫得到的為組分3，梯度70:30～60:40洗脫得到的為組分4，梯度60:40～50:50洗脫得到的為組分5，梯度50:50～40:60洗脫得到的為組分6，梯度40:60～30:70洗脫得到的為組分7，梯度30:70～20:80洗脫得到的為組分8，梯度20:80～10:90洗脫得到的為組分9，梯度10:90～0:100洗脫得到的為組分10，其中組分4先經正相硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶劑，洗脫2-5個柱體積，減壓濃縮后再經sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為chcl3:meoh＝1:1的混合溶劑，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝55:45，依次得到化合物ii(20.0mg)、iv(2.8mg)、vi(10.0mg)，組分5先經sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為meoh，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝75:25，依次得到化合物iii(18.9mg)、viii(2.5mg)，組分6經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為mecn:h2o＝75:25，依次得到化合物vii(3.0mg)、v(2.7mg)。
化合物ii-viii結構如下：
結構鑒定數據如下：
化合物ii：(1r,4r,5s,6,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6-二乙酰氧基-12-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環氧-新克羅烷-15,16-內酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經hresi(+)ms(m/z593.2366[m+na]+，理論值593.2357)確定其分子式為c31h38o10；根據1h，13c及二維核磁共振數據確定其結構，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoida，其1h和13cnmr數據歸屬見表1.[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cdcl3]。
化合物iii：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6-二乙酰氧基-7,12-二苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環氧-新克羅烷-15,16-內酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經hresi(+)ms(m/z713.3372[m+na]+，理論值713.3374)確定其分子式為c38h42o12；根據1h，13c及二維核磁共振數據確定其結構，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoide，其1h和13cnmr數據歸屬見表2.[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cdcl3]。
化合物iv：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6,7-三乙酰氧基-12-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環氧-新克羅烷-15,16-內酯為無定形粉末，易溶于氯仿。經hresi(+)ms(m/z651.2428[m+na]+，理論值651.2412)確定其分子式為c33h40o12；根據1h，13c及二維核磁共振數據確定其結構，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidf，其1h和13cnmr數據歸屬見表2.[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cdcl3]。
化合物v：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1-羥基-6-乙酰氧基-7,12-二苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環氧-新克羅烷-15,16-內酯為無定形粉末，易溶于氯仿。經hresi(+)ms(m/z671.2578[m+na]+，理論值671.2577)確定其分子式為c36h40o11；根據1h，13c及二維核磁共振數據確定其結構，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidm，其1h和13cnmr數據歸屬見表3.[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cdcl3]。
化合物vi：(1r,4r,5s,6s,8s,9r,10r,12s,13r)-6,12-二乙酰氧基-1-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環氧-新克羅烷-15,16-內酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經hresi(+)ms(m/z593.2358[m+na]+，理論值593.2357)確定其分子式為c31h38o10；根據1h，13c及二維核磁共振數據確定其結構，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidc，其1h和13cnmr數據歸屬見表2.[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cdcl3]。
化合物vii：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-6,7,12-三乙酰氧基-1-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環氧-新克羅烷-15,16-內酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經hresi(+)ms(m/z651.2428[m+na]+，理論值651.2412)確定其分子式為c33h40o12；根據1h，13c及二維核磁共振數據確定其結構，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidl，其1h和13cnmr數據歸屬見表3.[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cdcl3]。
化合物viii：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6,12-三乙酰氧基-7-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環氧-新克羅烷-15,16-內酯為無定形粉末，易溶于氯仿。經hresi(+)ms(m/z651.2428[m+na]+，理論值651.2412)確定其分子式為c33h40o12；根據1h，13c及二維核磁共振數據確定其結構，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidh，其1h和13cnmr數據歸屬見表3.[400mhz(1h)，100mhz(13c)，溶劑：cdcl3]。
表1.化合物ii的1h-nmr和13c-nmr數據[δ(ppm),j(hz)]
表2.化合物iii、iv、vi的1h-nmr和13c-nmr數據[δ(ppm),j(hz)]
表3.化合物v、vii、viii的1h-nmr和13c-nmr數據[δ(ppm),j(hz)]
實施例2
(1)將陰干的藍花黃芩全草(2.0kg)粉碎，用95％的乙醇溶液(4l)加熱50-60℃提取2次，每次提取3h，合并提取液，減壓濃縮得粗提物(約310g)；
(2)將步驟(1)得到的粗提物用適量的水(930ml)稀釋制成懸浮液后，依次用等體積的石油醚(930ml)萃取3次，合并石油醚相，減壓濃縮得浸膏(約22g)；
(3)將步驟(2)得到的浸膏，先經減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每個梯度收集兩個柱體積，根據極性大小分成10個組分，其中梯度100:0～90:10洗脫得到的為組分1，梯度90:10～80:20洗脫得到的為組分2，梯度80:20～70:30洗脫得到的為組分3，梯度70:30～60:40洗脫得到的為組分4，梯度60:40～50:50洗脫得到的為組分5，梯度50:50～40:60洗脫得到的為組分6，梯度40:60～30:70洗脫得到的為組分7，梯度30:70～20:80洗脫得到的為組分8，梯度20:80～10:90洗脫得到的為組分9，梯度10:90～0:100洗脫得到的為組分10，其中組分4先經正相硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶劑，洗脫2-5個柱體積，減壓濃縮后再經sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為chcl3:meoh＝1:1的混合溶劑，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝55:45，依次得到化合物ii(20.2mg)、iv(2.6mg)、vi(11.0mg)，組分5先經sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為meoh，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝75:25，依次得到化合物iii(19.0mg)、viii(2.5mg)，組分6經高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為mecn:h2o＝75:25，依次得到化合物vii(3.2mg)、v(2.9mg)。
化合物ii-viii的結構確證數據與實施例1一致。
實施例3：藥理活性實驗
實驗材料
細胞：人體t淋巴細胞c8166、mt-4,實驗病毒株hiv-1iiib。
細胞培養液：含10％胎牛血清(fbs)，rpmi-1640完全培養基，2mml-谷氨酰胺，10mmhepes，100,000iu/l青霉素，50μm2-巰基乙醇，100μg/ml鏈霉素。
試劑：hepes(n-2(2-hydroxyothyl)piperazine-n′-(2-ethanesufonicacid),mtt[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide]、谷氨酰胺(glutamine)、青霉素(penicillin)、硫酸鏈霉素(streptomycinsulfate)均購自sigma公司；rpmi-1640和胎牛血清(fbs)為invitrogen公司產品；2-巰基乙醇(2-me,2-mercaptoethanol)為bio-rad公司產品；ldh試劑盒(takara)，poly(a)×[dt]15(roche)，3h-dttp(perkinelmer)，microscinttmps(perkinelmer)。
實驗方法
hiv-1感染性滴定
將hiv-1iiib貯存液在96孔板上作4倍稀釋，分10個梯度，每梯度6個重復孔，同時設置對照孔6孔。每孔加入c8166細胞50μl，每孔終體積為200μl。在37℃,5％co2培養。第3天補加新鮮rpmi-1640完全培養基100μl，第7天在倒置顯微鏡下觀察每孔中hiv-1iiib誘導的細胞病變效應(cytopathiceffect,cpe)，以每孔是否有合胞體(syncytium)的形成確定；按reed&muench方法計算病毒的tcid50(50％tissuecultureinfectiondose)。
細胞毒性實驗
將4×105個/mlc8166懸液100μl與不同的待測藥物溶液混合，設置3個重復孔。同時設置不含藥物的對照孔，以azt為陽性藥物對照。在37℃，5％co2的條件下培養3天，采用mtt比色法檢測細胞毒性。elx800酶標儀測定od值，測定波長為570nm。計算得到cc50值(50％cytotoxicconcentration)，即對50％的正常t淋巴細胞系c8166產生毒性時的藥物濃度。
hiv-1致細胞病變(cpe)的抑制實驗
將8×105個/ml正常人體t淋巴細胞系c8166移取50μl/孔接種到含有100μl/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細胞培養板上，然后滴加50μl的hiv-1iiib稀釋上清液，1300tcid50/孔，每孔終體積為200μl，設置3個重復孔。同時設置不含藥物的正常細胞對照孔，以azt為陽性藥物對照。在37℃，5％co2的條件下培養3天，倒置顯微鏡下(100×)計數合胞體的形成。ec50(50％effectiveconcentration)為抑制合胞體形成50％時的化合物濃度。
統計方法
根據實驗結果，采用origin7.5繪制折線圖，按reed&muench法計算出樣品抑制病毒的50％有效濃度(ec50)，50％抑制細胞生長濃度(cc50)及抗hiv-1活性的治療指數ti值(therapeuticindex)為：ti＝cc50/ec50.
(1)細胞生長存活率(％)＝實驗孔od值/對照孔od值×100
(2)hiv-1致細胞病變的抑制率(％)＝(1-實驗孔合胞體數/對照孔合胞體數)×10
實驗結果
對hiv-1致細胞病變的抑制作用結果見下表4.。結果表明藍花黃芩石油醚部位的乙醇粗提物表現出較好的抗hiv-1活性，從石油醚部位分離的新克羅烷型二萜對hiv-1病毒有微弱的抑制作用。
表4.本發明化合物ii-viii及步驟(1)得到的粗提物的抗hiv-1活性
bti＝cc50/ec50.
c陽性對照藥物:3'-疊氮-3'-脫氧胸苷。