一株內生枯草芽孢桿菌YC01及其在防治油茶炭疽病中的應用的制作方法

本發明屬于植物病害生物修復領域，具體地說，涉及一株內生枯草芽孢桿菌yc01及其蛋白與脂肽提取物在在防治油茶炭疽病中的應用。
背景技術：
：油茶是我國特有的木本油料作物，主要分布于我國南方地區，與油棕、油橄欖和油椰子并稱為世界四大木本食用油樹種，世界上約90％的油茶籽油產量來自于中國。油茶產業是湖南省農林生產的特色產業，湖南省是國內最大的油茶產地和最大的茶油消費區。根據《湖南省油茶產業發展規劃(2011-2020年)》，到2020年，湖南將建成2200萬畝高產油茶園，年產值400億元以上，成為湖南省農業產業的支撐產業。油茶炭疽病是油茶最重要的病害之一，其病原菌主要是膠孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)，廣泛分布于我國南方各省，可引起油茶樹嚴重的落蕾和落果，落果率通常在20％左右，嚴重時高達50％。當前對油茶炭疽病的防治主要通過種植抗性品種和化學防治來控制，但長期的化學防治導致有害生物抗性問題日益嚴重，且化學農藥殘留造成嚴重的危害，如造成殘毒、污染環境，對人體健康、生態環境造成了很大的威脅，不利于油茶產業的可持續發展。由于生物防治與環境的良好兼容性，給植物病蟲害防治提供了新的思路與選擇。目前應用較多的生防細菌主要包括芽孢桿菌(bacillus)、假單胞菌(pseudomonas)、土壤放射桿菌(agrobacteriumradiobacter)等。枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是一種嗜溫性的好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，是芽孢桿菌科芽孢桿菌屬最具代表性的菌種，這種內生芽孢的桿狀細菌也是研究革蘭氏陽性細菌細胞生物學的模式菌株。枯草芽孢桿菌可以作為作物病害生物防治的良好資源，具有廣泛的應用前景。技術實現要素：本發明提供了一株內生枯草芽孢桿菌菌株，可以作為油茶生產上油茶炭疽病的良好生物防治菌劑，并且為油茶炭疽病的田間生物防治提供依據。本發明提供了一株從油茶健葉分離得到的內生生防菌，經鑒定為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，編號yc01，于2017年5月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.14186。本發明菌株對油茶炭疽病菌具有較好的拮抗效果，根據菌株形態學特征、生理生化特征、16srdna序列同源性分析，將菌株yc01鑒定為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。本發明所述枯草芽孢桿菌yc01的菌劑可采用lb培養基，按常規方法進行培養。本發明還提供含有所述枯草芽孢桿菌yc01的菌劑。所述菌劑的制備方法為：lb培養基接種菌種yc01，160-200r/min，25-28℃條件下發酵培養4-8天。根據不同的應用方面制備成液體制劑或固體制劑。具體地，一種含有所述枯草芽孢桿菌yc01的液體菌劑的制備方法包括：用250ml三角瓶裝100ml液體lb培養基，常規滅菌，冷卻后在超凈工作臺上，挑取yc01菌體接種入發酵三角瓶中，振蕩培養，28℃，160r/min條件下培養24h馬上轉入發酵罐發酵，28℃，160r/min條件下培養96h中止發酵。發酵液采用塑料瓶或者塑料袋進行分裝。本發明還包括上述內生枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)yc01，其代謝產物、蛋白粗提物、脂肽粗提物以及含其菌劑在防治油茶炭疽病中的應用。本發明所述內生枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)yc01的代謝產物、蛋白粗提物、脂肽粗提物均可按本領域常規方法制備。本發明菌株可應用于生產上油茶炭疽病的生物防治，以及與化學農藥協同防治油茶炭疽病；防治效果顯著。附圖說明圖1為本發明菌株yc01的菌落形態照片；圖2表示本發明菌株yc01對油茶炭疽病菌的平板拮抗效果；圖3為本發明菌株yc01菌株的系統發育樹；圖4表示本發明菌株yc01發酵液中蛋白(db)提取物對油茶炭疽病的防治效果；圖5表示本發明菌株yc01發酵液中脂肽(zt)提取物對油茶炭疽病的防治效果。本發明菌株yc01的16srdna序列見seqno.3。具體實施方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1拮抗菌株的分離與鑒定采用平板劃線法從油茶健葉分離得到一株對油茶炭疽病菌有較好拮抗作用的內生生防菌yc01，yc01菌落形態如圖1所示。1、培養基：lb培養基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g(固體培養基加瓊脂15g)，1000ml去離子水，ph7.0，高壓蒸汽滅菌121℃，30min。2、內生拮抗菌分離純化選取油茶健葉，用水沖洗干凈葉片表面，選取適量的健葉組織，稱量后剪成4mm2的組織塊，在75％乙醇中浸泡60s，然后在0.1％升汞溶液中浸泡40s，再放入75％乙醇浸泡30s，取出健葉組織塊用無菌水沖洗4次，徹底去除消毒液。在無菌研缽內加入10ml無菌水和少許滅菌的石英砂研磨成勻漿，加蓋靜置30min，將勻漿用無菌水進行10倍系列梯度稀釋，用移液槍分別吸取0.1ml稀釋液至滅菌的lb平板，涂抹均勻后放入培養箱培養，36-48h后根據菌落形態、顏色和大小挑取不同菌落，并分別在lb平板上進行純化保存。平板對峙法初篩：將直徑為6mm的油茶炭疽病菌放于pda平板中央，然后用接菌環蘸取待測細菌的懸浮液等距離(距平板中央3cm)點接2-3種內生細菌，培養箱中28℃條件下培養，4d后觀察記錄抑菌帶的有無及大小，重復3次，選取抑菌帶寬度較大的菌落進行復篩。發酵法復篩：將初篩的內生拮抗菌在lb平板上活化后，用接菌環移取一環放入50ml液體lb培養基中，28℃、160rpm條件下振蕩培養72h。細菌培養液經離心去除菌體后用0.22μm細菌過濾器過濾，將濾液與約50℃的pda培養基按1:19比例混勻后倒入培養皿，冷卻后在平板中央放入直徑為6mm的油茶炭疽病菌菌餅(或水稻紋枯病)，用無菌水作為空白對照，4d后用十字交叉法測量病菌菌落直徑，選出抑菌效果最好的菌株，保存備用。病原菌生長抑制率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑*100％發酵法復篩結果表明，yc01發酵液對油茶炭疽病菌的抑制效果可達85％以上(圖2)。3、菌株yc01的鑒定yc01形態特征：yc01菌株菌落在lb培養基上表面粗糙不透明，污白色或微黃色(圖1)。掃描電鏡下菌體呈短桿狀。yc01菌株生理生化特性：革蘭氏染色陽性，接觸酶、氧化酶、vp試驗、葡萄糖利用、甘露醇水解、淀粉水解、明膠液化試驗陽性。分子鑒定：采用試劑盒提取降解菌dna，所用擴增引物由上海生工合成：上游引物為5’-cagagtttgatcctggct-3’，下游引物為5’-aggaggtgatccagccgca-3’。擴增反應體系為：10×buffer(mg2+)2.5μl，dntps1μl，引物各0.5μl，菌體dna0.5μl，taqdna聚合酶0.2μl，加去離子水至25μl。pcr反應條件：94℃4min，94℃45s，55℃40s，72℃60s；30個循環；最后于72℃修復延伸10min，4℃條件下終止反應。pcr產物采用瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒進行目的片段回收，回收產物測序工作由上海生工公司完成。測序結果進入genbank數據庫進行比對。將yc01菌株的16srdna序列(即seqno.3)共1509bp登陸到genbank進行比對并構建系統發育樹(圖3)，將其鑒定為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。將該菌于2017年5月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.14186。實施例2yc01菌株對油茶炭疽病的防治效果將實施例1分離的yc01菌株轉入新鮮的lb平板上進行活化，隨后挑取菌落轉入液體lb培養基振蕩培養4d，將發酵液進行離心去除菌體，上清液備用。采集葉齡一致的健康油茶新生葉片，用75％酒精對葉片進行表面消毒后用無菌水將葉片表面殘留酒精沖洗干凈，置于培養皿中，油茶葉片葉柄用脫脂棉包裹，并用無菌水保濕。用滅菌的接種針刺傷葉片的上表面但不刺穿，每個葉片刺傷一處。將油茶炭疽病菌轉入新鮮的pda平板進行活化，28℃條件下連續培養4-5d，在菌落邊緣用打孔器打取直徑6mm的菌絲塊，將菌絲塊接種于油茶葉片刺傷處，每個處理10片葉片。共設置ck組(油茶葉片刺傷并接種炭疽病菌菌絲塊)、control組(健康油茶葉片且不接種炭疽病菌菌絲塊)、處理組(油茶葉片刺傷后，以yc01發酵液上清液均勻涂抹葉片，隨后接種炭疽病菌菌絲塊于刺傷處)。接種5d后逐天觀察油茶葉片發病情況并記錄統計。結果見表1。表1菌株yc01發酵液對油茶炭疽病的防治效果處理葉數發病葉數發病率防治效果ck10990％--control1000--yc01處理10220％77.8％結果表明，yc01發酵液對油茶炭疽病的防治效果達到77.8％。實施例3菌株yc01蛋白粗提物對油茶炭疽病的防治效果將實施例1分離的yc01菌株轉入新鮮的lb平板上進行活化，隨后挑取菌落轉入液體lb培養基振蕩培養4d，將發酵液進行離心去除菌體，上清液備用。上清液采用飽和硫酸銨法(相對飽和度50％)沉淀蛋白成分。蛋白處理辦法同實施例2，共設置ck組(油茶葉片刺傷并接種炭疽病菌菌絲塊)、control組(健康油茶葉片且不接種炭疽病菌菌絲塊)、處理組(油茶葉片刺傷后，以yc01蛋白提取物稀釋液均勻涂抹葉片，隨后接種炭疽病菌菌絲塊于刺傷處)。接種5d后逐天觀察油茶葉片發病情況并記錄統計。結果見表2。表2菌株yc01蛋白提取物對油茶炭疽病的防治效果處理葉數發病葉數發病率防治效果ck1010100％--control1000--蛋白提取物處理10110％90％結果表明，yc01發酵液蛋白提取物對油茶炭疽病防治效果可達90％(圖4)。實施例4菌株yc01脂肽粗提物對油茶炭疽病的防治效果將實施例1分離的yc01菌株轉入新鮮的lb平板上進行活化，隨后挑取菌落轉入液體lb培養基振蕩培養4d，將發酵液進行離心去除菌體，上清液備用。上清液采用鹽酸沉降的方法分離其拮抗活性成分，用鹽酸將上清液調節ph至2.0并沉淀過夜，然后10000r/min條件下離心20min，得到沉淀，沉淀用甲醇抽提2次，每次抽提2h，合并甲醇抽提物。甲醇抽提物減壓濃縮后過0.22μm濾膜，即為脂肽類化合物粗提物。脂肽處理辦法同實施例2，共設置ck組(油茶葉片刺傷并接種炭疽病菌菌絲塊)、control組(健康油茶葉片且不接種炭疽病菌菌絲塊)、處理組(油茶葉片刺傷后，以yc01脂肽提取物稀釋液均勻涂抹葉片，隨后接種炭疽病菌菌絲塊于刺傷處)。接種5d后逐天觀察油茶葉片發病情況并記錄統計。結果見表3。表3菌株yc01脂肽提取物對油茶炭疽病的防治效果處理葉數發病葉數發病率防治效果ck10990％--control1000--脂肽提取物處理10110％88.9％結果表明，yc01發酵液中脂肽提取物對油茶炭疽病防治效果可達88.9％(圖5).實施例5菌株yc01微生態菌劑的制備活化實施例1分離的菌株yc01，接種至液體lb培養基，160r/min，28℃恒溫箱培養96h。yc01液體制劑的制備：用250ml三角瓶裝100ml液體lb培養基，常規滅菌，冷卻后在超凈工作臺上，挑取yc01菌體接種入發酵三角瓶中，振蕩培養，28℃，160r/min條件下培養24h馬上轉入發酵罐發酵，28℃，160r/min條件下培養96h中止發酵。發酵液采用塑料瓶或者塑料袋進行分裝。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。sequencelisting<110>湖南農業大學<120>一株內生枯草芽孢桿菌yc01及其在防治油茶炭疽病中的應用<130>khp171113966.5<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1cagagtttgatcctggct18<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1aggaggtgatccagccgca19<210>3<211>1509<212>dna<213>枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）yc01<400>1ggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgtcccaccttcggcggctggctcctaa60aaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtac120aaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagctt180cacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaa240cctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcata300aggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcacct360tagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggactta420acccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccg480aaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgc540gttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttga600gtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcacta660aggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtat720ctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcg780ccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattcca840ctctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggg900gctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggaca960acgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggt1020taggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagc1080tttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccatt1140gcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgt1200ggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcacca1260actagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctg1320aaccatgcggttcagacaaccatctggtattagccccggtttcccggagttatcccagtc1380ttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagct1440cccatctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccag1500gatcaaact1509當前第1頁12