短小芽孢桿菌RP01及其應用的制作方法

本發明屬于生物農業科技應用領域，具體涉及短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01及其應用。

背景技術：

1904年，德國微生物學家最早提出了植物根際(rhizosphere)這個概念，指植物根周圍數毫米的區域范圍。植物根際是植物根系與土壤界面的一個微環境，是土壤、根系和微生物三者緊密結合的相互作用位點。根際微生物種群主要是以細菌為主，根據其對植物的作用不同，根際細菌(rhizobacteria)大體上可以分為有益細菌(2％-5％)，有害細菌(8％-15％)和中性細菌(80％-90％)三大類。植物根際促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria，pgpr)是指能自由生活于土壤中或定植于植物根際的一類可促進植物生長或抑制病原菌活動的菌群，通常指具有固氮、溶磷、解鉀、分泌抗生素和產生植物激素等能力或者具有其中之一能力的有益細菌。其中，能夠將土壤中植物難以吸收利用的磷轉化為植物可吸收利用的有效磷，這種微生物即為溶磷微生物(phosphatesolubilizingmicroorganism，psm)，包括分解有機磷化合物的有機磷細菌和能夠分解無機磷化合物的無機磷細菌。

微生物肥料(microbialfertilizers)是指以微生物的生命活動為核心，導致農作物獲得特定的肥料效應的一類肥料制品。衡量微生物肥料的質量標準的核心是無害和有效原則。由于我國在微生物肥料方面的研究投入少，使我國的生物肥料產業依然處于整體水平不高、技術創新不足、產品質量和應用效果不穩定的缺點，這些都制約著我國微生物肥料的進一步推廣和普及。結合世界農業可持續發展的前提，我國微生物肥料的發展趨勢主要包括以下四大方面：1)選育優良菌種；2)不同功能菌株的組合；3)研發多功能微生物肥料；4)重點產品的研究和應用。

土壤微生物群落的多樣性決定了土壤微生態系統功能的多樣性。接種外源微生物肥料的有效性長期以來一直是學術界的熱點爭議問題，這主要歸因于外源促生菌自身無法與土著優勢微生物種群進行競爭而導致的定殖能力低下、遺傳性狀不穩定等。紫色土是中國典型的土壤類型，廣泛覆蓋于中國四川盆地。在紫色土中單一接種pgpr對植物的促生效應等已有一定研究，如固氮菌、硅酸鹽細菌等。但是，大多數相關研究都是基于對土壤或基質進行滅菌后，再開展接種pgpr對于植物的促生等效應的研究，所引種的外源性菌劑在大田試驗條件下，均因生態適應性差等問題，無法與土著微生物競爭而“湮滅”，無法實現對作物的促生效應。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種對植物生長有促進作用的益生菌，該菌株具有溶解無機磷的功能；本發明的目的之二在于提供短小芽孢桿菌rp01在制備微生物肥料菌劑中應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno：13472。短小芽孢桿菌rp01屬芽孢桿菌屬的一種好氧菌，菌體呈細桿狀，單個細胞為0.6～0.7μm×2.0～3.0μm；孢子呈橢圓型，生長位置為中生，莢膜肥厚；菌落表面濕潤透明，難以挑起，邊緣整齊。

2、權利要求1所述的短小芽孢桿菌rp01在作為植物生長促生菌中的應用。

進一步，所述促生菌為具有溶解無機磷功能的促生菌。

進一步，所述植物為煙草幼苗。

進一步，所述短小芽孢桿菌rp01的接種濃度為10⁶cfu/ml。

進一步，所述煙草幼苗生長具體為株高、總根長和葉面積的增長。

3、權利要求1所述的短小芽孢桿菌rp01在制備微生物肥料菌劑中應用。

進一步，所述微生物肥料菌劑為微生物溶磷菌劑。

本發明的有益效果在于：本發明公開了短小芽孢桿菌rp01，該菌株具有溶解無機磷的功能，能夠有效促進植物生長，經實驗測定，在pko無機磷培養基上，當菌體濃度為1×10⁷cfu/ml時，28℃、120r/min培養7天，其發酵液溶磷含量高達129.0±11.89mg/l，表現出較高的無機磷溶解能力。可將其用于制備微生物肥料菌劑，能夠有效改善我國南方酸性土壤中農作物磷素營養，從而減少化肥的使用。

生物材料保藏

短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01于2016年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno：13472。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為顯微鏡(1600倍)下短小芽孢桿菌rp01經染色后的形貌圖。

具體實施方式

下面將對本發明的優選實施例進行詳細的描述。

實施例1

短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01的篩選與鑒定

一、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01的篩選

1、材料準備

(1)供試土壤

土壤采集自重慶市北碚區在西南大學國家紫色土肥力與肥料效應監測基地的輪作蔬菜(萵苣-辣椒-大豆-小白菜)中，樣地為種植蔬菜十年以上，且蔬菜產量和質量都較高的種植區。選擇3塊1×1m范圍土壤，按5點采樣法隨機收集10-20cm土壤，將土樣混合均勻后，置于冰桶內，帶回實驗室于4℃冰箱保存備用。土壤基本理化性質見表1。

表1供試土壤基本理化性質

(2)配置培養基

溶磷菌選擇培養基：nacl0.2g；mgso4·7h2o0.1g；mnso4·4h2o0.03g；kcl0.3g；(nh4)2so40.5g；feso4·7h2o0.003g；ca3(po4)23.0g；葡萄糖10g；瓊脂15g；去離子水1l；ph中性7.0-7.2。

lb培養基：nacl10g；酵母粉5g；胰蛋白胨10g；瓊脂15g；去離子水1l；ph中性7.0-7.2。

2、菌株分離、純化

稱取10g上述供試土壤懸溶于90ml無菌水中，28℃、120r/min振蕩2h，選擇稀釋梯度分別為10^-4、10^-5、10^-6和10^-7，分別取100μl涂于溶磷菌選擇培養基上，28℃下培養3-5d。挑取生長速度快或周圍有透明圈的菌株，使用劃線法于溶磷菌選擇培養基分離純化，直至純培養后轉接至lb培養基中斜面培養，獲得菌種，并將篩選出的菌種標記為rp01，并于-80℃下保存。

二、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01的鑒定

1、形態學鑒定

將上述保藏菌種rp01經溶磷菌選擇培養基活化后，觀察其菌落形態特征，通過觀察可知，菌種rp01在溶磷菌選擇培養基上能形成明顯的溶磷圈，菌落表面濕潤透明，難以挑起，邊緣整齊，培養1-2d后，菌落直徑2-3mm，培養3-5d后，菌落直徑5-6mm。挑取菌種進行革蘭氏染色、莢膜染色和芽孢染色后于顯微鏡(1600倍)下觀察菌體形態，如圖1所示，由圖1可知，革蘭氏染色菌體為陽性，孢子呈橢圓型，孢子囊未見膨脹，生長位置為中生，莢膜肥厚。

2、生理生化鑒定

參照東秀珠(2001)的常見細菌鑒定手冊，對上述分離、純化后的菌種進行生理生化鑒定，具體實驗方法如下，鑒定結果見表2：

(1)接觸酶試驗：挑取一小環活化24h的rp01菌種，涂抹于已滴有5％(v/v)過氧化氫的載玻片上，如有氣泡產生則為接觸酶陽性反應，無氣泡產生則接觸酶為陰性反應。

(2)氧化酶試驗：配制1.0％(w/v)二甲基對苯二胺水溶液，滴在濾紙上使濾紙剛好濕潤。取活化24h的rp01菌種，用玻璃棒刮取少許菌苔涂在濕潤的濾紙上。在10s內菌苔或其邊緣呈現紅色者為氧化酶陽性反應，在30s內出現紅色者為遲緩陽性，不呈現紅色或30s以后才呈現紅色則屬氧化酶陰性反應。

(3)甲基紅(m-r)試驗：甲基紅試劑(即稱取甲基紅0.02g溶于60ml體積分數為95％的酒精中，再加40ml水混勻)，接種活化24h的rp01菌種于裝有滅菌后的葡萄糖蛋白胨培養液的試管中，37℃培養24h后，沿管壁加入3-4滴甲基紅試劑混勻，放置，觀察是否變色，若培養液由橘黃色變為紅色則為m-r陽性反應。

(4)乙酰甲基甲醇(v-p)試驗：操作同m-r試驗，v-p試劑為40％(w/v)koh溶液15滴，再加入等量α-萘酚溶液(α-萘酚5.0g溶于100ml無水酒精中)，混合均勻，再加入肌酸lmg，猛烈振蕩，10min內變為紅色即v-p陽性反應。

(5)淀粉水解試驗：在牛肉膏蛋白棟培養基平板中加入0.2％(w/v)的可溶性淀粉，用接種環取少量活化24h的rp01菌種點接在配置好的培養基表面，28℃培養24h后，滴加少量的碘液均勻鋪滿于平板中。菌落周圍如出現無色透明圈，則表示該菌具有分解淀粉的能力，則為淀粉水解陽性反應，無透明圈則為淀粉水解陰性反應。

(6)硝酸還原酶試驗：接種活化24h的rp01菌種于硝酸鹽還原培養液中，37℃培養48h，分成兩管，其中一管加入格利斯亞硝酸試劑a(0.5g磺胺酸溶于150ml30％(v/v)醋酸溶液中)、格利斯亞硝酸試劑b(0.5gα-萘酚加入50ml蒸餾水中，煮沸后加入150ml30％(v/v)醋酸溶液)各1滴，如出現紅色，則為陽性反應。不出現紅色，則在另一管中加入少量鋅粉，加熱，再加入格利斯亞硝酸試劑a、b各1滴，如出現紅色，則為硝酸還原酶陰性反應；如不出現紅色，則為硝酸還原酶陽性反應。

(7)糖類發酵試驗：將活化24h的rp01菌種穿刺接種于培養基(1.0g(nh4)h2po4，0.2gmgso4，0.2gkcl，酵母膏0.2g，瓊脂5g，葡萄糖或木糖10g，蒸餾水1000ml，0.04％(w/v)溴甲酚紫酒精溶液20ml)中，適溫培養3d后觀察顏色變化，若指示劑變黃，表示糖醇發酵產酸，為陽性；不變或變藍(紫)則為陰性。瓊脂柱中若有氣泡出現，則表示為產氣反應。

(8)明膠液化試驗：用穿刺接種法接種活化24h的rp01菌種于明膠液化培養基(蛋白胨5g；明膠150g；水1000ml；ph7.2-7.4)中，20℃培養48h后，觀察培養基有無液化情況，若液化，則為明膠液化陽性反應。

(9)吲哚試驗：將活化24h的rp01菌種接種于裝有1％(w/v)胰蛋白胨水溶液培養基(ph7.5)的試管中，37℃培養24h后，在培養液中加入乙醚約lml，充分振蕩后靜置片刻，再沿管壁加入吲哚試劑(對位二甲基苯甲醛3.0g，戊醇75.0ml，濃鹽酸25.0ml)。如有吲哚存在，乙醚層呈現玫瑰紅色，則為吲哚陽性反應。

(10)檸檬酸鹽利用試驗：接種活化24h的rp01菌種于檸檬酸鹽斜面培養基(檸檬酸鈉2.0g；1.0gnh3h2po4；1.0gk2hpo4；5.0gnacl；0.2gmgso4；1.5g瓊脂；0.04％(w/v)苯酚紅10ml；水1000ml)上，37℃培養36h，若斜面呈藍色則為檸檬酸鹽利用陽性反應，不變色為檸檬酸鹽利用陰性反應。

(11)苯丙氨酸脫氨酶試驗：接種活化24h的rp01菌種于苯丙氨酸斜面培養基(5.0gnacl；1.0gna2po4；3.0g酵母膏；1.0gl-苯丙氨酸；15g瓊脂；水1000ml)上，36℃培養24h，滴加10％(w/v)fecl3試劑3-5滴，自斜面上方流下，若出現綠色則為苯丙氨酸脫氨酶陽性反應。

表2分離、純化后所得菌種rp01生理生化特征表

注：“+”表示反應為陽性，“－”表示反應為陰性

由表2可知，分離、純化所得的菌種rp01的生理生化特征為：接觸酶、v-p試驗及檸檬酸鹽利用等試驗呈現陽性；氧化酶、m-r試驗、硝酸還原酶、吲哚試驗及苯丙氨酸脫氨酶試驗呈現陰性；能液化明膠，不能水解淀粉。

3、分子生物學鑒定

16srdna序列鑒定上述保藏的菌種rp01的種屬，具體方法如下：菌種活化后，接種于lb液體培養基(28℃、120r/min)振蕩培養24h，再采用takaraminibestbacteriagenomicdnaextractionkitver.3.0提取細菌全基因組dna，以此為模板進行聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)，即用細菌通用引物27f和1492r擴增16s核糖體序列，引物27f的序列為：5′—agagtttgatcatggctcag—3′，引物1492r的序列為：5′—tacggttaccttgttacgactf—3′。擴增條件為：25μlpremixtaq(takarataqtmversion2.0plusdye)，濃度均為5μm的引物27f和1492r各2μl，1.0μl模板dna，去離子水20μl。擴增程序為：95℃預變性5min，95℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸2min，循環30次，然后72℃延伸10min，得到擴增后的dna樣品。將pcr擴增產物送交上海英濰捷基貿易有限公司純化、測序，結果如seqidno.1。將測序后的16srdna序列提交ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行blast比對并對其同源序列用mega6.06軟件的neighbor-join法構建系統發育樹。基于16srdna系統發育分析結果表明該菌株與登錄號為j254673的短小芽孢桿菌處于同一最小分枝，且與多株短小芽孢桿菌屬菌株相似度達到99％以上，結合菌株的形態學特征、生理生化特征，并參照《常見細菌系統鑒定手冊》，將其命名為短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01，簡稱rp01。

實施例2

短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01溶磷能力的測定

參照文獻(虞偉斌，2010)的方法，配制lb液體培養基，取100ml分裝于250ml三角瓶中。高壓滅菌后，接種rp01，28℃、120r/min培養24h，稀釋發酵液菌體濃度至10⁸cfu/ml，備用。

配制溶磷菌選擇液體培養基，取100ml分裝于250ml三角瓶中，在121℃下高壓滅菌30min后，試驗組接種2ml上述菌體濃度為10⁸cfu/ml的發酵菌液，對照組加2ml經高溫滅菌的lb液體培養基，每個處理重復三次。均在28℃、120r/min培養7d。用稀釋平皿菌落計數法(溶磷細菌選擇培養基，28℃培養3d)測定發酵終止的菌數；用ph計測定發酵終止的ph值；取發酵液以5000r/min離心10min，收集10ml上清液，采用鉬銻抗比色法測定發酵液中可溶性磷含量，結果見表3。

表3菌種rp01溶磷能力測試結果

注：同一列中標記不同小寫字母表示處理間差異達5％顯著水平。

由表3可知，接種rp01菌種后發酵液可溶性磷含量較對照組顯著增加，ph較對照組降低，可見，rp01菌種在酸性條件下具有優異的溶磷能力。

實施例3

短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)rp01對煙草幼苗促生能力的測定

將培養皿滅菌后，鋪上濾紙，用蒸餾水潤濕，將k326煙草種子均勻的鋪在濾紙上，25±1℃催芽3-4d(期間保持培養皿濾紙濕潤)。將催芽后的煙草種子轉移到裝有基質(60％腐植土+40％珍珠巖)的育苗穴盤中，每穴放2粒經催芽的煙草種子，其上用基質覆蓋，出苗后每穴保留一株煙苗。

待煙草長到3-4葉1心時開始接種rp01菌液(菌液按實施例2方法制備)。設置3個處理：對照、菌液濃度10³cfu/ml和10⁶cfu/ml兩個試驗組。四次重復，每穴接種1ml菌液(對照接種1ml培養基)，每隔7d接菌1次，共接菌4次，待最后一次接菌后30d和60d，測定煙草株高，地徑，葉面積，葉片數，根長。結果見表4。

表4接種rp01菌種30d和60d后煙草幼苗生長情況

注：同一列中“*”表示不同處理間具有顯著性差異：“*”表示達到p≤0.05顯著水平、“**”表示達到p≤0.01極顯著水平。

由表4可知，雖接種濃度為10³cfu/mlrp01菌液后煙草幼苗的株高、總根長和葉面積與對照相比，差異并不明顯，但是當接種濃度為10⁶cfu/mlrp01菌液后，煙草幼苗的株高、總根長和葉面積與對照相比顯著增長，差異達到極顯著，可見，當rp01達到一定濃度后，能明顯促進煙草植株生長。

最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。

sequencelisting

<110>重慶師范大學

<120>短小芽孢桿菌rp01及其應用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1422

<212>dna

<213>短小芽孢桿菌（bacilluspumilus）

<220>

<223>16srdna序列

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