一株小盾殼霉菌株及其應用的制作方法

本發明涉及生物農藥技術領域，尤其是涉及一株對植物菌核病具有生物防治作用的小盾殼霉菌株jn-cm(coniothyriumminitans)cgmccno.8325。

背景技術：

菌核病是由核盤菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)引起的一種世界性分布的植物病害，對油菜、向日葵、蔬菜等重要經濟作物的產量和品質影響嚴重，給農業生產帶來巨大損失。菌核病均在油菜、向日葵等油料作物開花期發病，發病部位位于地表上部10cm植物根莖部，發展速度快，發病面積每周以指數級數增加。以油菜為例，我國每年需防治面積都超過種植面積的50％，達到5000萬畝以上。

現階段我國防治菌核病的主要措施是使用化學殺菌劑，存在的主要問題：(1)長期使用化學農藥，將導致核盤菌產生抗藥性并使農藥用量不斷增加，作物體內農藥殘留不斷升高，對人體健康產生危害和引起環境污染等系列問題。(2)使用化學農藥殺滅核盤菌的同時也殺死了許多授花的蜜蜂等天敵昆蟲，破壞了生態平衡，不利于油菜等作物的生長。(3)由于作物菌核病發病期和發病部位的特殊性，以及作物密集種植的特點，噴灑等傳統施藥方法無法有效到達作物根莖部等主要發病部位，防治效果大幅下降。

因此，采用生物農藥防治菌核病就成了一種必然趨勢，其中，以小盾殼霉對菌核病的防治效果最佳。小盾殼霉(c.minitans)是核盤菌的天然寄生性真菌(天敵)，與核盤菌共存于土壤之中，由美國學者campbell于1947年首先發現。自上世紀七十年代開始，國內外學者已經在盾殼霉的生物學特性，對核盤菌的生防作用機制等方面進行了深入的研究。研究表明，小盾殼霉通過重寄生作用侵染菌核，在溶菌和抗生作用下，導致菌核的腐爛和菌體的死亡，達到防治菌核病的目的。

長期使用小盾殼霉，可在土壤中可以形成一定的菌群優勢，有效降低核盤菌在土壤中數量，產生長期防治的效果。更重要的是小盾殼霉具有對核盤菌專一、無抗性，無毒無殘留，對環境友好等特點，是一種典型的以菌克菌的綠色生物防治技術。實踐表明，有些農戶希望能把小盾殼霉與化學農藥或化肥一起混合使用，以簡化手續，降低勞動強度和生產成本。為此，需要使小盾殼霉對菌核凈等化學殺菌劑具有抗性作用。但是混用的前提是，小盾殼霉必須對所聯用的化學殺菌劑具有穩定的抗性。

技術實現要素：

針對現有技術存在的上述問題，本申請提供了一株小盾殼霉菌株及其應用。本菌株可以防治多種植物菌核病。

本發明的技術方案如下：

本申請提供了一株小盾殼霉菌株(coniothyriumminitans)，所述菌株于2013年10月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.8325。

本申請還提供了小盾殼霉菌株(coniothyriumminitans)cgmccno.8325的所有生物學純培養物。

本申請還提供了所述的小盾殼霉菌株(coniothyriumminitans)cgmccno.8325及其所有生物學純培養物在植物菌核病生物防治中的應用。

本申請還提供了所述的小盾殼霉菌株(coniothyriumminitans)cgmccno.8325及其所有生物學純培養物的應用方法：與菌核凈、福美雙、異菌脲、腐霉利等化學殺菌聯合使用。

本發明有益的技術效果在于：

本發明自油菜地土壤中，采用核盤菌菌核誘捕法，分離到一株微生物菌株，通過對其進行進一步篩選，獲得了既對核盤菌具有較強寄生作用又對化學殺菌劑腐霉利、菌核凈、福美雙、異菌脲具有較強抗性且遺傳穩定的菌株。經常規鑒定和分子鑒定為小盾殼霉菌株jn-cm(coniothyriumminitans)cgmccno.8325。

本菌株在pda培養基上菌落的菌絲初期為無色，隨著菌落的生長呈白色絨狀，背面也為白色，菌落產孢后呈黑色或由褐色轉變為黑色，孢子器吐出黑色水滴，水滴中包含溢出的分生孢子。菌落扁平，邊緣纖毛狀。分生孢子梗聚集，有橫隔，有分枝，直立，壁光滑。產孢細胞呈瓶狀，簇生于分生孢子梗頂端。分生孢子為單細胞，呈橢圓形，表面粗糙，有不規則突起，大小約為7-12μm×3-5μm。最適生長溫度為20℃，最適生長ph為6。

附圖說明

圖1分別為本菌株在pda培養基上培養3、7、10天的菌落形態。

圖2分別為本菌株分生孢子和菌絲的光學顯微照片。

圖3分別為本菌株分生孢子和菌絲的電子顯微鏡照片。

圖4為本菌株的its序列及其系統發育樹。

具體實施方式

下面結合附圖，對本發明進行具體描述。其目的是為更好理解本發明的內容。因此，所舉之例并不限制本發明的保護范圍。

實施例1：小盾殼霉菌株的分離

分別稱取100g4個不同地區的油菜田土樣于250ml塑料燒杯中，埋入50粒核盤菌菌核并混勻，蓋上紗布防止污染，放入20℃恒溫培養箱中，保持一定的土壤濕度誘捕培養28d后取出菌核。將已明顯腐爛的菌核用去離子水洗滌，除去表面的土壤后放入0.5％naclo溶液中消毒1min，再用無菌水洗滌3次。將洗過的菌核用無菌玻璃棒充分搗碎，加無菌水用4層擦鏡紙過濾，將濾液梯度適度稀釋后涂布于pda平板上，20℃培養5d后觀察平板內菌落生長情況，挑取盾殼霉疑似菌株進行純化直至純培養。

實施例2：小盾殼霉cgmccno.8325對核盤菌菌核致腐能力的測定

稱取40目過篩后的江沙20g置于培養皿內，165℃下干熱滅菌3h，冷卻后每個培養皿內放入20個核盤菌菌核(大小約為7mm×5mm)，然后加入4ml上述分離純化的小盾殼霉菌株的分生孢子懸液(10⁶cfu/ml)，充分攪拌混勻，置于20℃下避光培養28d后取出，觀察盾殼霉對核盤菌菌核的寄生致腐作用。每個樣品進行三組平行，并以4ml無菌水代替上述小盾殼霉菌株的孢子懸液作為對照組。以校正致腐率表示小盾殼霉菌株對核盤菌菌核的致腐能力，計算公式如下：

致腐率f＝腐爛菌核數/菌核總數×100％；

校正致腐率f＝(fj-f0)/(1-f0)×100％，其中fj表示樣品組的致腐率，f0表示對照組的致腐率。

經測定，小盾殼霉菌株cgmccno.8325對油菜核盤菌菌核的校正致腐率為95.6±4.7％；對向日葵核盤菌菌核的校正致腐率為91.6±5.2％；對蔬菜核盤菌(來自于萵苣)菌核的校正致腐率為88.9±3.4％。

小盾殼霉菌株cgmccno.8325對各種植物核盤菌菌核都具有較高的校正致腐率，說明其對來自于不同植物的核盤菌均具有較強寄生作用。

實施例3：小盾殼霉cgmccno.8325對化學殺菌劑抗性的測定

將腐霉利(procymidone)、菌核凈(dimetachlone)、福美雙(thiram)和異菌脲(iprodione)等4種化學殺菌劑，分別制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0和10.0μga.i./ml等不同濃度梯度的含藥pda平板。用12mm打孔器切取10天菌齡的cgmccno.8325菌株，接種至上述平板中央，每種殺菌劑的每個濃度分別設置5個平行實驗，以不加殺菌劑的pda平板為對照組。將接種后的平板放入20℃的培養箱中培養7天用十字交叉法測量每個平板內的菌落直徑，將測量所得的菌落直徑平均值減去接種塊直徑既得菌絲生長直徑，按下式計算各殺菌劑濃度對菌株菌絲生長的抑制率a(％)。將抑制率對殺菌劑濃度進行回歸分析，得到各殺菌劑對cgmccno.8325菌株菌絲生長的毒力方程。據此計算各殺菌劑對cgmccno.8325菌株菌絲生長的有效抑制中濃度(ec50，即對菌絲生長抑制率50％所對應的殺菌劑濃度)。

式中：a：抑制百分率；

di：不同濃度試劑下菌絲生長直徑的平均值；

d0：對照組所菌絲生長直徑的平均值。

經測定，各種化學殺菌劑對小盾殼霉菌株cgmccno.8325菌絲生長的有效抑制中濃度ec50分別為：腐霉利66.20μga.i./ml；菌核凈552.33μga.i./ml；福美雙98.10μga.i./ml；異菌脲133.78μga.i./ml。較高的ec50表明小盾殼霉菌株cgmccno.8325對上述4種化學殺菌劑具有一定的抗性。

取小盾殼霉cgmccno.8325的分生孢子懸液(10⁶～10⁷cfu/ml)100μl分別涂布于含100μga.i./ml的腐霉利、菌核凈、福美雙或異菌脲等4種殺菌劑的pda平板上，20℃避光培養5d，觀察生長情況。發現小盾殼霉cgmccno.8325菌株在上述平板上均能生長，說明小盾殼霉cgmccno.8325菌株可以抗100μga.i./ml的4種化學殺菌劑。

實施例4：小盾殼霉cgmccno.8325對化學殺菌劑抗性的遺傳穩定性的測定

將小盾殼霉菌株cgmccno.8325在pda斜面上連續傳代10次，按實例3所述方法測定傳代后(f10)的ec50，結果為：腐霉利63.40μga.i./ml；菌核凈646.03μga.i./ml；福美雙75.61μga.i./ml；異菌脲128.39μga.i./ml。和實例3中所測得的傳代前的數值相比，ec50均只是略有下降，仍然保持在較高水平。表明小盾殼霉cgmccno.8325對化學殺菌劑的抗性具有較高遺傳穩定性。

將連續傳代10次的小盾殼霉cgmccno.8325的分生孢子懸液(10⁶～10⁷cfu/ml)100μl按實例3所述方法，分別涂布于含100μga.i./ml的腐霉利、菌核凈、福美雙或異菌脲的pda平板上，20℃避光培養5d，觀察生長情況。發現傳代后(f10)的cgmccno.8325在上述平板上均能生長，說明小盾殼霉cgmccno.8325菌株在連續傳代10次后仍可以抗100μga.i./ml的4種化學殺菌劑。再次證明小盾殼霉cgmccno.8325對化學殺菌劑的抗性具有遺傳穩定性。

實施例5：小盾殼霉cgmccno.8325的個體與菌落形態觀察

將小盾殼霉cgmccno.8325點植于pda平板中央，20℃培養觀察，記錄菌落生長變化情況。培養成熟后對菌株菌絲及孢子進行普通顯微鏡和掃描電鏡觀察。

cgmccno.8325菌絲初期為無色，隨著菌落的生長，菌絲一邊擴展，菌落表面一邊形成白色分生孢子器，菌落扁平、中間部分突起，表面光滑，氣生菌絲不發達，呈白色絨狀，背面也為白色，生長速度中等，菌落扁平，邊緣纖毛狀。再經過一段時間的培養后，菌落逐漸變褐，菌落產孢后呈黑色或由褐色轉變為黑色，孢子器吐出黑色水滴即為溢出的分生孢子(見附圖1)。

cgmccno.8325分生孢子在光學顯微鏡下為單細胞，橢圓形，褐色，不透明；菌絲在光鏡下無色、較粗、有分枝，有明顯的橫隔；分生孢子器黑色，近球形，高400～600μm，直徑350～500μm，具孔口，聚生或散生于菌絲中，分生孢子梗有橫隔，有分枝，直立，壁光滑。產孢細胞呈瓶狀，簇生于分生孢子梗頂端(見附圖2)。

cgmccno.8325分生孢子在掃描電鏡下為橢球狀，表面不光滑，有不規則突起，大小約為4～6μm×3～4μm；菌絲在掃描電鏡下為圓柱形，表面不光滑，有細小突起，有明顯的分枝，主干較粗，支干較細，有橫隔，但不明顯(見附圖3)。

實施例6：cgmccno.8325的分子生物學鑒定

將cgmccno.8325接種至100mlpdb培養基中，20℃，150r/min培養10d，培養后的菌絲懸浮液進行離心(10000r/min)，去上清液，-80℃條件下凍存2～3h后取出，用液氮研磨破壁至粉末狀，將破壁后的菌液按真菌基因組提取試劑盒方法提取基因組，提取得到的dna溶解液在-20℃條件下保存。

特異性基因片段的pcr擴增采用真菌通用引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，引物序列如下：

上游引物(its1)：5ˊ－tccgtaggtgaacctgcgg－3ˊ

下游引物(its4)：5ˊ－tcctccgcttattgatatgc－3ˊ

以上述提取的cgmccno.8325染色體dna為模板，pcr反應體系如下：染色體dna模板2μl；10×taqbuffer5μl；dntps(2.5mm)5μl；

上游引物(5μm)0.5μl；下游引物(5μm)0.5μl；pfudna聚合酶2.5μl；ddh2o34.5μl；總體積50μl。

pcr反應條件如下：pcr反應條件為：94℃4min，94℃30s→55℃30s→72℃30s，35個循環，72℃10min。

pcr產物采用pcr產物純化試劑盒(上海生工)進行純化，純化產物經瓊脂糖凝膠電泳(1.4％瓊脂糖)驗證，并送生工生物工程(上海)有限公司測序，測序結果及構建系統發育樹見附圖4。

經常規和分子鑒定，本菌株被命名為小盾殼霉(coniothyriumminitans)jn-cm，該菌株已送至中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)保藏，保藏號為cgmccno.8325。