一株對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌及其構建方法與應用與流程

本發明屬于環保技術領域，具體涉及一種對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌重組菌株的及其構建方法與環保領域上的應用。

背景技術：

五氯苯酚(pentachlorophenol,pcp)，又名五氯酚；常含一分子結晶水，稍熱有極強辛辣臭味。五氯苯酚能阻止真菌生長、抑制細菌，長期以來被用做除草劑、殺蟲、殺菌劑、防霉劑等。然而，pcp在所有酚類中毒性物質中的毒性最大，具有很強的“三致”(致癌、致畸、致突變)效應。1970年代，美國環境保護局已將其納入優先污染物名單(waterres.，2004，38：663-672)，在我國，pcp被列為水環境優先控制的68種污染物名單。五氯苯酚不易被氧化，也難于水解，有蓄積作用，它能夠在生物中大量富集，并且濃度遠遠超過它在水中的濃度。pcp在土壤或積淀物上，具有很高的吸附性，能被植物吸收，通過生物富集進入食物鏈(trendsinbiotehcnolgoy,20:243-248.)。pcp的生物危害性在自然環境中的遷移、轉化及其降解，一直是業界研究和關注的熱點。

五氯苯酚的處理方法，主要物理法，化學法和生物法三種。物理法主要包括吸附法、丫射線法、超聲波法等。化學法主要包括電化學、fenton試劑法、零價金屬還原法、二氧化錳法等。生物法中包含很多種微生物，不同種類的微生物由于其降解污染物的生化機制不同，使得pcp的降解途徑多樣化，但降解過程均為先脫氯轉化為低氯代化合物后再開環得到降解或礦化。pcp的生物降解過程中最重要的限制步驟是氯取代基的去除，pcp的生物脫氯主要有氧化脫氯機制和厭氧還原脫氯機制(appliedandenvironmentalmicrobiology,75:5910-5918.)。其中，厭氧還原脫氯機制是最常見和有效的降解方法。

生物法具有成本低、效率高、無二次污染、不破壞環境等優點，將在pcp治理過程中有廣闊的應用前景。厭氧還原脫氯過程中，一些fe(iii)還原菌bacillus、geobacter、pesudomonas和clostridium等起到極其重要的作用(scienceofthetotalenvironment,473:215-223.)。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一株經過二型內含子基因插入失活技術得到的對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌。

本發明還要解決的技術問題是提供上述拜氏梭菌在對五氯苯酚脫氯方面的應用，以提高生物法降解pcp的效率。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌，在拜氏梭菌中失活cbei_3304基因，使該基因在拜氏梭菌中不能正常表達。cbei_3304基因編碼一種疑似膜蛋白，此膜蛋白的功能缺失，能夠提高胞內一些物質的交換與流動性，進而提升拜氏梭菌對五氯苯酚的脫氯效率。

其中，所述cbei_3304基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

其中，所述拜氏梭菌為拜氏梭菌ncimb8052。

上述對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)將內含子序列構建到二型內含子基因敲除質粒中，得到重組質粒；

(2)將步驟(1)得到的重組質粒轉化拜氏梭菌，篩選得到cbei_3304基因失活的菌株，既得到五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌。

優選地，所述內含子序列的核苷酸序列如seqidno：2所示，內含子序列的插入位點為seqidno：1中第335bp和第336bp之間。

優選地，所述二型內含子基因敲除質粒為pwj質粒。

上述對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌的構建方法，所述拜氏梭菌為拜氏梭菌ncimb8052。

上述對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌的構建方法構建得到的拜氏梭菌在本發明發保護范圍之內。

上述拜氏梭菌在對五氯苯酚高效脫氯還原中的應用在本發明的保護范圍之內。該菌株可以用于土壤、水體中五氯苯酚的脫除。

本發明的有益效果是：

本發明將拜氏梭菌中編碼膜蛋白的cbei_3304基因進行插入失活后，使得此基因不能正常表達，獲得cbei_3304基因插入失活的重組菌株，既重組菌株m-3304，在含有3.0mg/l的五氯苯酚、0.15g/l甲基紫精(mv)和6.44g/l檸檬酸鐵甲的模擬廢水中，60小時內，五氯苯酚的還原脫氯率達到90％；在同等條件下，而出發菌株拜氏梭菌ncimb8052對五氯苯酚的還原脫氯率只有40％；拜氏梭菌重組菌m-3304對五氯苯酚的還原脫氯效率，是出發菌株的2.25倍。本發明得到的重組菌是一株適用于五氯苯酚還原脫氯的優良菌種，可廣泛應用于水、固體垃圾、固體廢棄物和土壤中五氯苯酚的降解，本發明屬于環保領域。

附圖說明

圖1為本發明插入失活載體pwj的質粒圖譜；

圖2為本發明使用二型內含子插入失活的機理圖；

圖3為轉化子菌落pcr電泳圖；泳道1、泳道2、泳道4為野生型菌株ncimb8052的cbei_3304基因片段大小，泳道3為插入失活突變株m-3304的cbei_3304基因片段大小，泳道5為marker；

圖4為本發明拜氏梭菌m-3304和初始菌株ncimb8052在模擬廢水中，對五氯苯酚的脫氯實驗結果。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。

實施例1：拜氏梭菌cbei_3304基因插入失活突變株的構建。

構建拜氏梭菌cbei_3304基因插入失活突變株的原理如圖2所示，具體構建過程包括以下步驟：

(1)cbei_3304插入失活載體的構建

1)設計內含子

根據ncbi數據庫收錄的拜氏梭菌的cbei_3304基因序列(如seqidno：1所示)，借助軟件設計合適的插入基因位點(http://www.clostron.com)，選擇插入在第101～102個堿基之間，并生成內含子序列，合成內含子序列s-304(其序列如seqidno：2所示)，并設計以下引物。

克隆引物：

pwj-osc-304-s：5’-ggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttacacttcgcc-3’，其序列如seqidno：3所示；

pwj-osc-304-a：5’-ggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataag-3’，其序列如seqidno：4所示。

驗證引物：

cbei-3304-t-s：5’-taaattacctacagcaaaactgtg-3’，序列如seqidno：5所示；

cbei-3304-t-a：5’-ggaattaagaaccttgaatctatc-3’，序列如seqidno：6所示。

引物pwj-osc-304-s引入xhoⅰ酶切位點(下劃線部分)，引物pwj-osc-304-a引入bsrgⅰ酶切位點(下劃線部分)。

2)cbei_3304-pwj-304重組載體構建

用xhoⅰ和bsrgⅰ雙酶切載體pwj，pwj質粒圖譜如圖1所示，其序列如seqidno：7所示。酶切產物經純化試劑盒(takara)純化后，與內含子序列s-304通過一步克隆(clonexpress)連接。將一步克隆連接的重組質粒轉化到大腸桿菌e.colidh5a，涂布到含有50μg/ml氨芐霉素抗性lb平板，37℃培養12～16h，挑取轉化子，接到液體含有50μg/ml氨芐霉素lb培養基中，37℃、200rpm培養12h，提取重組質粒(axygen)，測序驗證，獲得cbei_3304-pwj-304重組載體。

3)cbei_3304-pwj-304重組載體的甲基化

制備e.colitop10/pan2的化學感受態，將測序成功的cbei_3304-pwj-304重組載體轉化到大腸桿菌e.colitop10，由于pan2質粒具有四環素抗性，故涂布到含有50μg/ml氨芐霉素和10μg/ml四環素雙抗性lb平板，37℃培養12～16h，挑取轉化子，接到液體含有50μg/ml氨芐霉素和10μg/ml四環素lb培養基中，37℃、200rpm培養12h，提取甲基化的cbei_3304-pwj-304重組載體(pan2質粒含有一個枯草芽孢桿菌噬菌體基因，能編碼甲基轉移酶，能實現外源質粒在大腸桿菌中的甲基化)，即cbei_3304插入失活載體。

(2)cbei_3304插入失活載體轉化拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)

1)將clostridiumbeijerinckiincimb8052接種至yps培養基(酵母粉3g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖1g/l，乙酸銨2g/l，氯化鈉3g/l，七水合硫酸鎂3g/l，磷酸二氫鉀1g/l，磷酸氫二鉀1g/l，七水合硫酸亞鐵0.1g/l，ph＝6。)37℃過夜培養，次日以5％比例接種到yps培養基，37℃培養6-8h，以10％接種到2×ytg培養基(酵母粉16g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉5g/l)37℃培養3h，od600nm＝1；

2)取50ml拜氏梭菌菌液，5000rpm，4℃離心10min，棄上清。在以etm緩沖液(270mm蔗糖，0.6mmna2hpo4，4.4mmna2hpo4，10mmmgcl2)重懸；同上離心，去上清，再次以etm緩沖液重懸，同上離心，徹底取上清；

3)以1mlet緩沖液(270mm蔗糖，0.6mmna2hpo4，4.4mmnah2po4重懸，取200μl，加入1ugcbei_3304插入失活載體，加入0.2cm預冷的電轉杯，輕輕混勻；

4)使用micropulsertm電轉儀電轉，條件為電壓1.8kv，電阻200ω，電容2.5μf，電擊后立刻加入1ml2×ytg培養基，轉移到無菌離心管中復蘇2～3h；

5)取200μl上述菌液，涂布到含有10μg/ml紅霉素的yps固體培養基，培養2～3天。

(3)cbei_3304插入失活突變株的篩選

挑取上述步驟5)中培養2～3天的轉化子，使用引物cbei-3304-t-s和cbei-3304-t-a對轉化子進行菌落pcr驗證，篩選出內含子插入基因組的突變株(插入后，pcr擴增出基因條帶電泳圖上比野生型大約1kbp)，如圖3所示，將正確插入的突變株傳代三次，同時涂布在含有紅霉素抗性和沒有紅霉素抗性的yps固體培養基上，篩選出敲除質粒丟失的突變株(在紅霉素抗性平板上不能生長的突變株)。

實施例2：拜氏梭菌在模擬廢水中對五氯苯酚的脫氯實驗。

(1)培養基配方：

yps培養基：酵母粉3g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖1g/l，乙酸銨2g/l，氯化鈉3g/l，七水合硫酸鎂3g/l，磷酸二氫鉀1g/l，磷酸氫二鉀1g/l，七水合硫酸亞鐵0.1g/l，ph＝6。

模擬廢水：葡萄糖2g/l，氯化鉀0.9g/l，氯化銨1.0g/l，一水合磷酸二氫鈉0.6g/l，一水合氯化鈣0.02g/l，酵母膏0.05g/l，電子介體(mv)0.15g/l，檸檬酸鐵6.44g/l,五氯苯酚3mg/l和微量元素(h3bo33g/l，znso4·7h2o0.9g/l,mncl2·2h2o2.4g/l,cuso4·5h2o0.6g/l,cocl2·6h2o3g/l,(nh4)6mo7o24·2h2o0.02g/l,nicl2·6h2o0.1g/l)5ml/l。

(2)在yps培養基中活化拜氏梭菌組菌m-3304和初始菌株ncimb8052，培養溫度37℃，厭氧培養時間12h。然后取40ml菌液，10000rpm離心5min，倒掉上清，將菌體轉接入20ml的模擬廢水中，通入n25分鐘，排出氧氣，迅速密封，培養溫度30℃，150rpm搖床培養。拜氏梭菌對模擬廢水中五氯苯酚的還原脫氯效果，如圖4所示。

可以看出，在60h時，拜氏梭菌重組菌m-3304對五氯苯酚的還原脫氯率達到了90％，同等條件下，而出發菌株ncimb8052對五氯苯酚的還原脫氯率只有40％左右。拜氏梭菌重組菌m-3304對五氯苯酚的還原脫氯效率，是出發菌株的2.25倍。

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<110>南京中泰生物科技有限公司

<120>一株對五氯苯酚高效脫氯的拜氏梭菌及其構建方法與應用

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