一種具有改善記憶功效的多肽及其分離制備方法和應用與流程

本發明屬于蛋白質精深加工領域，具體涉及一種具有改善記憶功效的多肽及其分離制備方法和應用。

背景技術：

研究表明，記憶的下降或退化與大腦海馬區病變、神經遞質減少以及突觸病變等有關。此外，發生在中樞神經系統(centralnervoussystem，cns)的氧化應激會隨著年齡的增加而增加，從而導致許多與年齡相關的神經退行性疾病的產生，如阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、多發性硬化癥等疾病。預計，在2050年前患者數將增加到1.15億。

人類大腦內神經遞質-乙酰膽堿的缺失是導致記憶損傷的重要因素之一。乙酰膽堿是人類神經細胞中重要的神經遞質，它能夠在突觸間進行神經信號的傳遞。但乙酰膽堿會被膽堿酯酶(cholinesterase,che)降解，過度的乙酰膽堿降解會導致乙酰膽堿含量降低，從而造成神經信號傳遞的失敗，導致記憶損傷。

目前，已經有許多乙酰膽堿酯酶抑制劑被列為研究對象。但某些抑制劑中，毒扁豆堿(physostigmine)及塔克林(tacrine)因貨架期短及肝毒性等副作用，而逐漸從市場上消失。因而安全無副作用的乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究吸引了人們的注意。對于天然、安全無副作用的乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選逐漸吸引了許多研究者的目光。

學者們對多種天然物質的酰膽堿酯酶抑制活性進行了系統研究，其中包括天然產物提取物、卵磷脂、多不飽和脂肪酸以及肽類物質等。天然產物提取物因成分復雜，可能存在試劑殘留等危害；卵磷脂、多不飽和脂肪酸因價格昂貴、提取工藝復雜而難以大范圍推廣。而肽類物質，具有來源廣泛、制備工藝簡單、無副作用等優點，逐漸成為研究熱點。

蛋白質和肽類物質具有維持腦細胞代謝，保持大腦的各種運動正常進行的功能。其中天然存在于哺乳動物中樞神經系統中的內源多肽約有200種，例如生長抑素(somatostatin，ss)、促皮質激素釋放因子(corticotropinreleasingfactor，crf)、加壓素(vasopressin，vp)、催乳素(prolactin，prl)、腦啡肽(enkephalin)、內啡肽(eindorphin)等已被證實對記憶具有調節作用。

目前也有很多學者采用生物酶解技術從植物或者動物組織中制備得到具有改善記憶的多肽。腦活素則是由豬腦水解后得到的含有85％游離氨基酸和15％低分子多肽的復合酶解產物，研究表明其具有改善記憶、保護神經細胞的作用，可以改善腦內神經遞質和相關酶的活性。

目前的研究多集中于混合物的記憶功效增強或者合成改善記憶肽序列的公開，評價手段多采用動物行為學，改善記憶多肽純品制備困難，評價指標過程繁瑣，且很少采用乙酰膽堿酯酶活性抑制能力來評價多肽。

鳳鱭(coiliamystus(1inaeus))，屬鯡形目，鯤科，鱭屬，稱為鳳尾魚、肉鱭等。鳳尾魚多用于制作罐頭產品。其魚肉中含15～20％的蛋白質，氨基酸組成合理，脂肪含量低，但局限于罐頭產品等附加值低，鑒于其產量穩定、價格低廉，適宜開發新方向，因此如何充分開發利用鳳尾魚蛋白質資源，提高其附加值，是魚肉蛋白資源綜合利用的重要環節。

技術實現要素：

為了克服現有改善記憶多肽純品制備困難的問題，本發明的首要目的在于提供一種具有改善記憶功效的多肽，其氨基酸序列為tyr-asn-glu。

本發明的另一目的在于提供上述多肽的分離制備方法。

本發明的再一目的在于提供上述多肽的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種多肽，其氨基酸序列為tyr-asn-glu,分子量為424.41da。

上述多肽的分離制備方法，包括如下步驟：

(1)將鳳尾魚去頭去內臟，絞成肉糜，加水混合，加入占肉糜質量0.5～1.2％的混合酶，在45～60℃下酶解6～10h后，滅酶，冷卻至室溫后，離心，過濾收集濾液，得到鳳尾魚酶解液；

步驟(1)所述的加水混合，水與肉糜的質量比為(1～3):1；

步驟(1)所述的混合酶，由木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成；其中木瓜蛋白酶占肉糜質量的0.2～0.5％，堿性蛋白酶占肉糜質量的0.3～0.7％；所述的堿性蛋白酶優選alcalase2.4l；

步驟(1)所述的滅酶是將反應物在95℃下加熱15min；

步驟(1)所述的離心優選在3500r/min轉速下離心10min；

(2)將鳳尾魚酶解液添加至sephadexg-25凝膠柱，用去離子水以0.5～1.5ml/min的流速進行洗脫，檢測波長為220nm，收集各洗脫峰并測定其乙酰膽堿酯酶抑制活性，選取乙酰膽堿酯酶抑制活性最高的組分進行下一步分離；

(3)采用反相高效液相色譜對步驟(2)選取的目標組分進一步純化，收集各洗脫峰并測定其乙酰膽堿酯酶抑制活性，乙酰膽堿酯酶抑制活性最高的組分即為本發明的多肽tyr-asn-glu；

步驟(3)所述的反相高效液相色譜優選以下參數：waterse2695hplc，2998pda檢測器，色譜柱為xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm,5μm,waters，usa)，流動相為a相和b相；a相是質量分數0.1％的三氟乙酸超純水溶液，b相為甲醇；

洗脫程序為：0-1min內采用的流動相中a與b體積比為(95:5)-(90:10)；1-35min內采用的流動相中a與b體積比為(95:5)-(60:40)或(90:10)-(70:30)；35-36min內采用的流動相中a與b體積比為60:40；36-40min內采用的流動相中a與b體積比為(60:40)-(95:5)或(60:40)-(90:10)，流速為1ml/min，檢測波長為220nm。

步驟(2)和(3)中所述的乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定方法如下：

將25μl含有7.5mm的硫代碘代乙酰膽堿溶液、50μlhepes溶液(0.75mm)、125μl含有0.5％牛血清蛋白的二硫代二硝基苯甲酸(3mm，ph7.4)和50μl樣品(即各洗脫峰對應組分)混合，37℃下孵育15min；然后向混合物中加入25μl乙酰膽堿酯酶(0.11u)，412nm處用酶標儀檢測(15min)各組吸光值。ache抑制率計算公式如下：

ache抑制率(％)＝[1-(a樣品-a樣品空白)/(a對照-a對照空白)]×100％

其中，對照組為不加樣品加ache組，對照空白組為不加樣品不加ache組。

本發明的多肽可用于制備具有改善記憶功效的藥品、保健品或食品。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

(1)本發明所用原料為鳳尾魚，來源廣泛，價格低廉，目前鳳尾魚多用于制作魚罐頭，現在將其作為蛋白原料，開發改善記憶肽，可顯著提高鳳尾魚原料的附加值。

(2)本發明采用生物酶解技術及色譜分離技術制備出一種具有明顯改善記憶作用的蛋白肽，制備方法簡單可行，制得的產品純度高。

(3)本發明提供的改善記憶肽活性優良，具有良好的乙酰膽堿酯酶抑制能力，可以作為功能性成分，用于保健品中。

(4)本發明提供的改善記憶肽為三肽產品，其肽分子量小，可被人體直接吸收。

(5)本發明通過化學合成對應的改善記憶肽，經實驗驗證效果與分離純化得到的新肽效果接近。

附圖說明

圖1為鳳尾魚酶解產物的sephadexg-25凝膠色譜分離洗脫曲線。

圖2為鳳尾魚酶解產物sephadexg-25凝膠色譜洗脫組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性測定結果。

圖3為凝膠色譜目標收集組分的反相高效液相色譜分離洗脫曲線。

圖4反相高效液相色譜分離洗脫組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性測定結果。

圖5為改善記憶肽的氨基酸序列質譜分析圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例

本發明多肽的分離制備方法，包括如下步驟：

(1)鳳尾魚去頭去內臟，清洗干凈后，放入攪拌機中制成肉糜；加入肉糜質量2倍的水，按肉糜質量的0.5％添加蛋白酶(以魚肉肉糜的質量為計算基準，木瓜蛋白酶的加入量占0.25％，alcalase2.4l的加入量占0.25％)，在45℃下保溫酶解6h，然后在95℃溫度下加熱15min滅酶，冷卻至室溫后，在3500r/min下離心10min，收集上清液，得到鳳尾魚蛋白酶解液；

(2)將鳳尾魚蛋白酶解液用sephadexg-25凝膠柱進行分離純化，用去離子水以0.5ml/min的流速進行洗脫，檢測波長為220nm，共收集到6個組分，洗脫曲線見圖1，測定各洗脫峰對應組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結果見圖2，組分fr.4活性最高，然后收集組分fr.4，采用反相高效液相色譜法對改組分進一步純化(waterse2695hplc，2998pda檢測器)，色譜柱為xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm,5μm,waters,usa)，流動相為a相(0.1％的三氟乙酸超純水溶液)和b相(乙腈)，洗脫程序為：0-1min內a:b為90:10(體積比,下同),1-35min內a:b為90:10-70:30，35-36min內a:b為70:30，36-40min內a:b為70:30-90:10，流速為1ml/min，檢測波長為220nm，共收集到10個峰，洗脫曲線見圖3，測定各洗脫峰對應組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結果見圖4，其中組分5活性最高，收集組分5，得到改善記憶肽。

(3)最后采用電噴霧串聯質譜測定步驟(2)中獲得的改善記憶肽的氨基酸序列。結果見圖5，改善記憶肽的氨基酸序列為tyr-asn-glu。

本發明制備的改善記憶肽與腦活素(cerebrolysin)的乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測結果如表1，并采用腦活素(cerebrolysin)作為對照，樣品及腦活素濃度為10mg/ml，結果如表1。

表1改善記憶肽及腦活素的乙酰膽堿酯酶抑制能力

注：改善記憶肽和腦活素檢測濃度為10mg/ml。

已有大量文獻報道，腦力記憶下降受損多與膽堿能系統的紊亂有關。由表1可知本發明制備的改善記憶肽具有優秀的乙酰膽堿酯酶抑制活性，具有潛在改善大腦膽堿能系統中乙酰膽的動態平衡狀態的作用，表明本發明提供的改善記憶肽具有較強的記憶改善功能，可用于藥品、保健品和食品等行業中。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。