轉基因玉米MON87403品系特異性實時熒光PCR檢測引物、探針、方法和試劑盒與流程

技術領域：

本發明屬于轉基因產品檢測領域，具體涉及轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒。

背景技術：
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mon87403由農桿菌介導插入擬南芥athb17基因編碼區全長序列。athb17是hd-zip家族植物轉錄因子成員，其蛋白結合于特定dna，調控基因表達。hd-zip蛋白家族在調節植物生長和進化中扮演重要角色。在mon87403植株中，玉米特異性的切割athb17使其翻譯成被刪節的蛋白athb17δ113，其丟失了起始的113n末端氨基酸。athb17δ113能調節抽穗組織中hd-zipii蛋白的活性，導致在早期生生殖階段穗的增加(穗的增加與光合作用產生的干物質相關)。

mon87403由農桿菌介導質粒pv-zmap5714插入玉米品系lh224近交系未成熟胚研制而成，pv-zmap5714質粒包括三個基因盒：athb17表達盒，cp4epsps篩選標志盒和aada表達盒。pv-zmap5714采用串聯t-dna方法產生無標記植物(cp4epsps基因盒在最初用來進行抗草甘膦除草劑特性篩選后通過傳統育種分離出去，轉基因植株中無cp4epsps基因)，轉基因植株中僅含有1拷貝的athb17表達盒。

mon87403于2015年上市，目前獲得批準的國家有澳大利(食品)、新西蘭(食品)、加拿大(食品和飼料及種植)、韓國(食品和飼料)和美國(食品、飼料及種植)5個國家。

目前對轉基因產品多數國家均采用相應的標識管理制度，品系特異性pcr(轉化事件特異性)(event-specificpcr)檢測的目標序列是外源插入序列與植物基因組間連接區，相較于篩選pcr(screeningpcr)、基因特異性pcr(gene-specificpcr)、構建特異性pcr(construct-specificpcr)具有更加高的具有高特異性，能用于檢測鑒定相同質粒轉化的轉基因具體品系，是目前轉基因品系鑒定檢測技術研究和實際檢測工作中的重要方法。

為打破其他國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，完善和我國轉基因產品定量檢測技術體系，保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，為進出境口岸監管部門提供轉基因不同品系標識檢測鑒定的方法，建立轉基因玉米mon87403品系特異性定量pcr精準檢測方法十分必要。

技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高、穩定性強，快速準確鑒別轉基因玉米mon87403品系的轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒。

本發明的第一個目的是提供轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

mon87403-f：5’-ataataacgctgcggacatctac-3’(如seqidno.1所示)；

mon87403-r：5’-gaatgagtgctctgtatcctccac-3’(如seqidno.2所示)。

本發明的第二個目的是提供一種轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示：

mon87403-p：5’-ccatcatactcattgcgatccacatttc-3’(如seqidno.3所示)，探針的5’端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團。

所述的熒光報告基團優選為fam，所述的熒光淬滅基團優選為bhq1。

本發明的第三個目的是提供一種轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測試劑盒，包括實時熒光定量pcr反應液、耐熱dna聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

mon87403-f：5’-ataataacgctgcggacatctac-3’；

mon87403-r：5’-gaatgagtgctctgtatcctccac-3’；

所述的檢測探針如下所示：

mon87403-p：5’-ccatcatactcattgcgatccacatttc-3’，探針的5’端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團。

本發明的第四個目的是提供一種轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣品的基因組dna作為模板；

(2)加入上述的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量pcr反應液及耐熱dna聚合酶混合形成擴增反應體系；

(3)將擴增反應體系在熒光pcp儀上進行實時熒光pcr反應，反應結束后，根據擴增曲線判斷樣品是否為轉基因玉米mon87403品系。

優選，所述的步驟(2)的擴增反應體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon87403-f和mon87403-r各0.4μl，10μmol/l檢測探針mon87403-p0.8μl，dna模板2μl和ddh2o8.7μl；所述的步驟(3)的實時熒光pcr反應，其反應程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環，于60℃收集熒光信號。

優選，所述的步驟(3)的根據擴增曲線判斷樣品是否為轉基因玉米mon87403品系的標準為：如果擴增曲線有典型熒光擴增曲線，則說明樣品為轉基因玉米mon87403品系；如果擴增曲線無典型熒光擴增曲線，則說明樣品不是轉基因玉米mon87403品系。

本發明的第五個目的是提供一種轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取轉基因玉米mon87403品系的基因組dna進行梯度稀釋以用作不同起始濃度的模板，分別加入上述的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量pcr反應液及耐熱dna聚合酶混合形成擴增反應體系，在熒光pcp儀上進行實時熒光pcr反應；

(2)反應后得到各起始濃度模板對應的ct值，該ct值與起始模板量的常用對數(lg)呈線性關系，據此得到該線性范圍內轉基因玉米mon87403品系的標準曲線；

(3)提取待測樣品的基因組dna，加入與步驟(1)中相同體系的上述的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量pcr反應液及耐熱dna聚合酶混合形成擴增反應體系，在熒光pcp儀上進行實時熒光pcr反應，反應后得到ct值，將其代入步驟(2)獲得的轉基因玉米mon87403品系的標準曲線，計算得到待檢樣品中轉基因玉米mon87403品系基因組dna的含量(拷貝數或質量)。

本發明具有以下優點及有益效果：

1.本發明打破國外其他國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘；

2.本發明彌補和完善了我國轉基因產品定量檢測技術體系。提供的技術用于轉基因產品的檢測可更加好的保護消費者的知情權和選擇權，滿足國家監管部門對轉基因產品的鑒定和標識需求。

3.本發明針對轉基因玉米mon87403品系特異性序列設計引物和taqman探針，建立轉基因玉米mon87403實時熒光聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)檢測方法。利用該檢測引物和檢測探針及建立的實時熒光pcr體系，按照本發明的方法定量檢測下限為32拷貝，建立的轉基因玉米mon87403品系的標準曲線方程為：y＝-3.4802x+39.91，r²＝0.99，擴增效率：94％(介于90％～110％)，表明本發明的轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測方法在模板量32-640000copies重復性實驗顯示本發明的方法的標準偏差(sd)及相對標準偏差(rsd)都在可接受范圍內，特異性良好、靈敏度高、穩定性強。

附圖說明：

圖1是退火溫度為58℃時擴增圖。

圖2是退火溫度為60℃時擴增圖。

圖3是轉基因玉米mon87403品系特異性檢測方法特異性實驗結果；1為hmg-mon87403質粒；2～14分別為：轉基因油菜mon88302、轉基因油菜dp-073496-4、轉基因棉花mon88913、轉基因大豆a2704-12、轉基因大豆gts40-30-2、轉基因玉米mon810、轉基因玉米bt11、轉基因玉米mir162、轉基因玉米nk603、轉基因甜菜h7-1、非轉基因玉米、陰性對照和空白對照。

圖4是轉基因棉花mon87403品系特異性檢測靈敏度試驗擴增圖；1～9分別為320000、32000、16000、3200、1600、320、160、32和16copies/μl質粒dna，10和11分別為陰性對照和空白對照。

圖5是實時熒光pcr檢測mon87403品系的標準曲線，log(copies)即為log10(copies)。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

主要材料：轉基因油菜mon88302、轉基因油菜dp-073496-4、轉基因棉花mon88913、轉基因大豆a2704-12、轉基因大豆gts40-30-2、轉基因玉米mon810、轉基因玉米bt11、轉基因玉米mir162、轉基因玉米nk603、轉基因甜菜h7-1、非轉基因玉米為本實驗室購置及保存，玉米內源基因選用玉米高速泳動蛋白基因(highmobilitygroupproteins,hmg,玉米中國單拷貝，genbank:aj131373.1)和轉基因玉米mon87403品系特異性片段雙基因陽性質粒(雙基因陽性質粒為將內源基因hmg基因片段150bp序列(如seqidno.4所示)和mon87403品系特異性片段200bp序列(如seqidno.5所示)的共350bp序列(如seqidno.6所示)克隆到ampr抗性的puc57載體上構建得到的重組質粒，將重組質粒轉入受體菌dh5a后-70℃保存。以下稱hmg-mon87403質粒，酶切位點bamhi)為本實驗室構建。

玉米內源基因選用玉米高速泳動蛋白基因(highmobilitygroupproteins,hmg,玉米中國單拷貝，genbank:aj131373.1)(參考文獻：mazzaram,fotin,savinic,vandeneedeg.reportontheverificationoftheperformanceofamon87403event-specificmethodonmaizelinemon87403usingreal-timepcr-validationreportandprotocol.eur24237en.2009.jrc56609,doi10.2788/59036)引物hmg-f/r和探針hmg-p用于檢測玉米樣品基因組dna是否成功提取以及是否適于進行實時熒光pcr擴增；其序列信息詳見表1。

主要試劑：primexextaq(2×)forqpcr，大連寶生物；dna提取試劑盒，北京天根公司；引物和探針由閃晶生物公司合成，稀釋為終濃度為10μm的工作液使用。

主要儀器與設備：

abi7500，abi7500fast實時熒光定量pcr儀，美國應用生物系統公司；qx200微滴式數字pcr系統，美國伯樂公司；nanodrop2000c微量分光光度計，美國thermo公司；研磨機，德國ika。

農作物材料樣品基因組dna采用常規方法提取與純化。

實施例1：實時熒光pcr檢測方法的建立與優化

根據轉基因玉米mon87403品系轉入的基因盒5’端與玉米基因組鄰接區序列(轉基因玉米mon87403品系特異性片段，如seqidno.5所示)，應用primerprimer5.0軟件設計引物和探針。將設計的引物、探針經ncbi網站上使用blast數據庫比對確定引物和探針的理論特異性；玉米內源基因hmg用于玉米來源樣品dna的檢測及轉基因成分的相對定量。具體引物探針信息見表1。

表1實時熒光pcr的引物、探針

對退火溫度及引物探針配比進行優化：

a組的擴增反應體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon87403-f和mon87403-r各0.5μl，10μmol/l檢測探針mon87403-p1μl，32000copies/μldna模板(轉基因玉米mon87403品系基因組dna)2μl和ddh2o8.3μl；

b組的擴增反應體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon87403-f和mon87403-r各0.4μl，10μmol/l檢測探針mon87403-p0.8μl，32000copies/μldna模板(轉基因玉米mon87403品系基因組dna)2μl和ddh2o8.7μl；

c組的擴增反應體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon87403-f和mon87403-r各0.2μl，10μmol/l檢測探針mon87403-p4μl，32000copies/μldna模板(轉基因玉米mon87403品系基因組dna)2μl和ddh2o5.9μl；

退火溫度為58℃時的反應程序為95℃30s；95℃5s、58℃34s，40個循環，于58℃收集熒光信號；

退火溫度為60℃時的反應程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環，于60℃收集熒光信號。

結果顯示：在退火溫度為58℃時的擴增圖如圖1所示，圖中從左到右分別為a、b和c組的擴增曲線，a和b組ct值接近，基于經濟性考慮選擇b組為本實驗的擴增反應體系；

在退火溫度為60℃時的擴增圖如圖2所示，圖中從左到右分別為a、b和c組的擴增曲線，b和c組ct值接近，a、b和c三組ct值與退火溫度在58℃時ct值接近。

綜合以上考慮，基于經濟性，酶的最佳反應溫度及擴增平臺應用的通用性(特別對于多重)，考慮選擇60℃作為退火溫度、b組為本實驗的擴增反應體系。

實施例2：實時熒光pcr方法特異性測試

提取轉基因油菜mon88302、轉基因油菜dp-073496-4、轉基因棉花mon88913、轉基因大豆a2704-12、轉基因大豆gts40-30-2、轉基因玉米mon810、轉基因玉米bt11、轉基因玉米mir162、轉基因玉米nk603、轉基因甜菜h7-1、非轉基因玉米的基因組dna為模板，陽性對照為hmg-mon87403質粒，陰性對照為非轉基因大米dna。對建立的實時熒光pcr檢測方法的特異性進行測試。

擴增反應體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物mon87403-f和mon87403-r各0.4μl，10μmol/l檢測探針mon87403-p0.8μl，dna模板2μl和ddh2o8.7μl；反應程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環，于60℃收集熒光信號。

結果顯示(圖3)，采用轉基因玉米mon87403品系特異性引物mon87403-f/r和探針mon87403-p進行實時熒光pcr時，只有陽性樣品hmg-mon87403質粒的dna模板有典型熒光擴增曲線，以其他農作物材料dna為模板的反應均無典型熒光擴增曲線。表明本發明的檢測方法特異性良好。

實施例3：靈敏度測試、可重復性測試及標準曲線建立

將提取的hmg-mon87403質粒dna溶液加te緩沖液分別稀釋至緩沖液稀釋至320000、32000、16000、3200、1600、320、160、32和16copies/μl作為dna模板進行轉基因玉米mon87403實時熒光pcr檢測，實時熒光pcr檢測反應體系和反應程序同實施例2，進行靈敏度測試：

測試結果顯示(圖4)，320000-16copies/μl范圍內9個梯度均能有典型擴增曲線，其最低檢測濃度為16copies/μl。擴增圖從左至右分別為緩沖液稀釋至320000、32000、16000、3200、1600、320、160、32和16copies/μl擴增曲線。

將提取的hmg-mon87403質粒dna溶液加te緩沖液分別稀釋至320000、32000、16000、3200、1600、320、160、32和16copies/μl作為dna模板，進行轉基因玉米mon87403品系實時熒光pcr檢測，進行線性范圍測試及可重復性測試，每個樣品進行3次重復實驗，水為空白對照，實時熒光pcr檢測反應體系和反應程序同實施例2：

測試結果的ct值如表2所示；根據表2中ct值數據與在32-640000copies范圍內9個濃度的對數值與所得ct值建立標準曲線(圖5)，線性回歸方程為：y＝-3.4802x+39.91，r2＝0.99，擴增效率：94％(介于90％～110％)，表明本發明的轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測方法在模板量32-640000copies范圍內線性相關性良好，擴增效率高，符合engl相關要求[definitionofminimumperformancerequirementsforanalyticalmethodsofgmotesting]；且在模板量為32-640000copies的線性范圍內，其ct值的sd介于0.07-0.30，rsd介于0.32％-0.90％，表明在線性范圍內最低模板量32copies時，其sd和rsd均小于25％，所以本發明的定量檢測下限為32copies。

表2實時熒光pcr方法的靈敏度及可重復性測試

本發明針對轉基因玉米mon87403品系轉入的基因盒5’端與玉米基因組鄰接區序列設計引物和探針，建立的轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測方法，可對轉基因玉米mon87403進行品系特異性快速、高通量的定性及精準定量檢測，滿足檢測、監管部門對其進行標識的需求。

序列表

<110>中華人民共和國黃埔出入境檢驗檢疫局

<120>轉基因玉米mon87403品系特異性實時熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒

<160>6

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ataataacgctgcggacatctac23

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gaatgagtgctctgtatcctccac24

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccatcatactcattgcgatccacatttc28

<210>4

<211>150

<212>dna

<213>玉米

<400>4

cctgagcgagtcggtaagctccatcttctgtactaaagtagtagttgattggactagaaa60

tctcgtgctgattaattgttttacgcgtgcgtttgtgtggattgtaggacaaggctccct120

atgtagccaaggctaacaagctcaagctcg150

<210>5

<211>200

<212>dna

<213>轉基因玉米mon87403

<400>5

taatttgtcgttttatcaaaatgtactttcattttataataacgctgcggacatctacat60

ttttgaattgaaaaaaaattggtaattactctttctttttctccatattgaccatcatac120

tcattgcgatccacatttccctacatggtggaggatacagagcactcattccggagtata180

atcttgtcttgtgttgccac200

<210>6

<211>350

<212>dna

<213>hmg-mon87403質粒

<400>6

cctgagcgagtcggtaagctccatcttctgtactaaagtagtagttgattggactagaaa60

tctcgtgctgattaattgttttacgcgtgcgtttgtgtggattgtaggacaaggctccct120

atgtagccaaggctaacaagctcaagctcgtaatttgtcgttttatcaaaatgtactttc180

attttataataacgctgcggacatctacatttttgaattgaaaaaaaattggtaattact240

ctttctttttctccatattgaccatcatactcattgcgatccacatttccctacatggtg300

gaggatacagagcactcattccggagtataatcttgtcttgtgttgccac350