一種基于單核苷酸多態性的葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型一體化方法與流程

本發明涉及藥品安全微生物檢測技術領域，具體涉及一種用于葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的引物組合物，以及一種葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型一體化方法。

背景技術：

隨著藥品生產質量規范和國家藥品質量標準的提升，藥品生產質量控制中對微生物檢驗要求和鑒定水平越來越高。新實施的《中國藥典》2015年版規定：微生物鑒定水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型；無菌試驗結果陽性時，對檢出微生物鑒定必要時需達到菌株水平；藥品微生物實驗室在過程控制中應具有通過對污染菌溯源分析，發現污染源的能力。

葡萄球菌屬在自然界中分布十分廣泛，傳統微生物檢驗方法通常以“凝固酶陽性”作為判定葡萄球菌具有致病性的重要標準，如凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌能夠引起化膿感染、敗血癥、肺炎等疾病，是藥品微生物檢驗中重要控制菌。但近些年研究發現，凝固酶陰性葡萄球菌(如表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌等)也是人類疾病重要病原體。環境微生物監測結果表明凝固酶陰性葡萄球菌是污染藥品、生產環境和檢測實驗室環境的主要微生物，占到50％以上。傳統微生物檢測方法僅關注“凝固酶陽性”葡萄球菌存在較大的安全風險，亟需建立能夠準確鑒定多種致病性葡萄球菌的方法。基于16srrna序列比對的方法目前被廣泛應用于細菌的鑒定，但有研究表明16srrna核酸序列在葡萄球菌屬中高度保守，對于親緣關系較近的葡萄球菌種的區分能力差[speciesidentificationofcoagulase-negativestaphylococci:genotypingissuperiortophenotyping_[j].veterinarymicrobiology,2009,134(1–2):20-28]，不能夠提供準確的鑒定結果，因此亟需在葡萄球菌屬中尋找新的區分能力強的靶基因用于葡萄球菌種水平的鑒定。

此外，《中國藥典》2015年版指出藥品微生物檢驗實驗室應具有對微生物分型溯源的能力。多位點序列分型方法(multilocussequencetyping，mlst)是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法。這種方法通過pcr擴增多個管家基因內部片段并測定其序列，利用管家基因序列之間的變異來區分不同菌株。mlst方法操作簡單，能快速得到菌株分型結果，便于不同實驗室進行數據比較分析，已經用于多種細菌的流行病學監測和進化研究。目前已經針對葡萄球菌屬中的金黃色葡萄球菌[multilocussequencetypingforcharacterizationofmethicillin-resistantandmethicillin-susceptibleclonesofstaphylococcusaureus[j].jclinmicrobiol38(3):1008-1015]、表皮葡萄球菌[improvedmultilocussequencetypingschemeforstaphylococcusepidermidis[j].jclinmicrobiol45(2):616-619]、人葡萄球菌[multilocussequencetypingandfurthergeneticcharacterizationoftheenigmaticpathogen,staphylococcushominis[j].plosone8(6):e66496]等建立了相應的mlst方法，但是這些葡萄球菌mlst分型方法所用的靶基因和引物都具有種特異性，并不能用于其它葡萄球菌菌株的分型。另外，mlst方法的應用需建立在菌株鑒定的基礎上，極大的降低了工作效率，提高了實驗成本。

因此，本領域的技術人員致力于開發一套基于核酸序列差異分析的，能夠同時實現多種葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的一體化方法。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種用于葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的靶基因及其對應的pcr擴增引物，及利用該pcr擴增引物對葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型一體化的方法，該方法能夠同時實現多種葡萄球菌種水平的鑒定和分型，提高了工作效率，降低了實驗成本。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一個目的是提供一種用于葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的靶基因，其為具有單核苷酸多態性特征的葡萄球菌持家基因，其包括fema(aminoacyltransferase)、ftsz(celldivisionprotein)、gap(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、pyrh(uridylatekinase)、rpob(rnapolymeraseb)和tufa(translationalelongationfactor)。

本發明之所以選擇fema、ftsz、gap、pyrh、rpob和tufa等6個持家基因作為葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型靶標是通過以下方法篩選到的：

從ncbi網站上下載57株代表性葡萄球菌全基因組序列，涵蓋28個葡萄球菌種。然后進行泛基因組學分析，通過以下篩選條件的設置：1)核心基因(coregenes)，2)靶基因編碼的氨基酸序列在葡萄球菌之間的同源性大于50％，3)靶基因在葡萄球菌基因組中必須是單拷貝基因，4)氨基酸序列長度大于200個氨基酸。進行泛基因組學數據整理分析，對篩選出的靶基因序列逐一進行序列分析，剔除有明顯片段缺失和沒有明顯保守區段的靶基因序列，最后篩選出具有單核苷酸多態性特征的葡萄球菌持家基因。

優選的，上述各靶基因的標準分析序列為seqidno：1～seqidno：6所示序列。

本發明的第二個目的是提供一種用于葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的引物組合物，其包括：

fema引物對：

fema-ftaayaaartcaccaacataytcseqidno：7

fema-rtymgntcatttatggaagatacseqidno：8

ftsz引物對：

ftsz-fgcbacdytdaargtyatyggseqidno：9

ftsz-rttrtcwtcraadccwgthgcseqidno：10

gap引物對：

gap-fatggttttggtagaattggtcgtttaseqidno：11

gap-rgacatttcgttatcataccaagctgseqidno：12

pyrh引物對：

pyrh-faytdagygghgaagcdytmgseqidno：13

pyrh-ragaargangangchgtwgaseqidno：14

rpob引物對：

rpob-fcaattcatggaccaagcseqidno：15

rpob-rccgtcccaagtcatgaaacseqidno：16

tufa引物對：

tufa-fccaatgccacaaactcgtseqidno：17

tufa-rcctgaaccaacagtacgtseqidno：18。

上述6個靶基因的pcr擴增引物是通過對ncbi數據庫中下載的葡萄球菌靶基因序列，序列比對分析后，利用primer5.0軟件在靶基因保守序列區域設計引物，然后對引物的有效性和通用性進行評價，最終篩選出6對性能較優的引物。所述6對pcr擴增引物序列，在葡萄球菌中具有較好的通用性，能夠實現葡萄球菌屬多種葡萄球菌的有效擴增。

本發明第三個目的是提供一種葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型一體化的方法，其包括以下步驟：

步驟1、提取待檢測菌株dna；

步驟2、將步驟1中提取的待檢測菌株dna作為模板，利用上述引物組合物分別對6種靶基因：fema、ftsz、gap、pyrh、rpob和tufa進行pcr擴增；

步驟3、通過凝膠電泳，檢測步驟2中所得的擴增產物，定性判斷待檢測菌株是否為葡萄球菌；

步驟4、將步驟3中定性判斷為葡萄球菌的產物進行核酸序列測定，

步驟5、將步驟4中的測定的6個靶基因的序列與對應靶基因的標準序列進行序列比對分析，截取片段大小一致的序列；

步驟6、將步驟5中截取的待檢測菌株靶基因序列按fema-ftsz-gap-pyrh-rpob-tufa順序進行序列串聯；

步驟7、將步驟6中所得的待檢測菌株串聯序列與葡萄球菌菌種數據庫中的標準菌株串聯序列進行聚類分析，構建鄰接法(neighbor-joiningmethod)進化樹，根據鄰接法進化樹中菌株之間的親緣聚類關系，進行葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型。

為了進一步優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括：

優選地，在步驟1和步驟2之間，包括篩選具有單核苷酸多態性的葡萄球菌持家基因fema、ftsz、gap、pyrh、rpob和tufa，作為葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的靶基因的步驟。

優選地，所述篩選方法為葡萄球菌泛基因組學分析方法，其篩選條件如下：1)核心基因(coregenes)，2)靶基因編碼的氨基酸序列在葡萄球菌之間的同源性大于50％，3)靶基因在葡萄球菌基因組中必須是單拷貝基因，4)氨基酸序列長度大于200個氨基酸。

優選地，所述葡萄球菌泛基因組學分析方法中包括57株代表性葡萄球菌全基因組序列，涵蓋28個葡萄球菌種。

優選地，所述葡萄球菌泛基因組學分析方法包括：

i)對氨基酸序列的比對分析，按同源性從高到低逐一進行序列分析，剔除有明顯片段缺失和沒有明顯保守區段的氨基酸靶序列；

ii)對篩選出的氨基酸靶序列的核酸序列進行比對分析，剔除沒有明顯保守區段的靶基因序列，篩選出具有單核苷酸多態性特征的葡萄球菌持家基因。

pcr的反應過程是本領域技術人員所能掌握的，一般為五步法，預變性、變性、退火、延伸、再延伸。根據本發明人研究，優選地，步驟2中的pcr擴增反應體系包括：takara2×premix預混液12.5μl，引物對(10μmol/l)各1.0μl，菌株dna模板2.0μl，使用滅菌ddh2o水補足20.0μl。

優選地，步驟2中的pcr擴增程序如下：

fema：95℃預變性5min，95℃預變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

ftsz：95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

gap：95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

pyrh：95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

rpob：95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

tufa：95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

優選地，所述步驟3中定性判斷待檢測菌株的標準為：如果凝膠電泳結果中出現6個靶基因的明顯亮色條帶，則表明該條帶對應的菌株為葡萄球菌菌株，否則為非葡萄球菌菌株。

優選地，所述步驟3中凝膠電泳可采用本領域常用的凝膠電泳類型，更優選為瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳，且對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。

本發明收集整理國家權威微生物菌種保藏中心葡萄球菌標準菌株，及經過明確鑒定的微生物檢驗實驗室常見葡萄球菌菌株。進行靶基因pcr擴增和核酸測序分析后，建立不同葡萄球菌種靶基因fema、ftsz、gap、pyrh、rpob和tufa的標準序列及串聯序列數據庫。將待檢測菌株的6個靶基因串聯序列與數據庫中不同葡萄球菌標準菌株進行比對和聚類分析，進行葡萄球菌菌種水平鑒定和菌株分型。

本發明分別在上述6個靶基因的snp多態性豐富的區域定義每個靶基因的標準分析序列(約500bp)，其序列如下所示：

fema標準分析序列(seqidno：1)：

tcttcggcatcttcactaaagtcaccactaataccatagaaattataccgatcaataccatgttcaattgcatagttaatcatcttccattgaaccgcatagctccctgcaaaatggcgataacgatttgaagttccaccagcgtagtaaactacttcaaacggattgattataaagaagccagcagagatgggtaattcattgccatgttcttgttttaagtttttggcttcattaattttttgctggtttgcatcaagttgttgttctaaattttcttttttgttatgtgcttttttattctctggacgcttctcaatgtcttttaaagctttattataatctttattaagcacatttctttcattatttagttcctctatgtactcatcgaagttaatataggctagtggtactaaaacacggtctttatagtgtttgaatctgttgtaataaaaactatcatctctatctgcaaaatctttagtttcagaggta；

ftsz標準分析序列(seqidno：2)：

acacgtggattaggtgctggtgctaatcctgaaattggaaagaaagcagcagaagaatcaagagaacaaattgaagatgctatccaaggtgctgatatggtattcgtaactgctggtatgggtggcggtactggaacaggtgctgcgccggttgttgctaaaattgcaaaagaaatgggtgctttaactgtaggtgttgttacgcgtccattcggtttcgaaggtcgtaagcgccaaacacaagcggcagctggtgtagaatctatgaaagcagcagtggatacattaattgttattccaaatgatcgcttattagatatcgttgacaaatctacgccgatgatggaagcatttaaagaagcggataatgtattacgtcaaggtgtacaaggtatttcagatttaattgcagtatcaggtgaagtgaacttagactttgcagacgttaaaacaattatgtctaatcaaggttctgcgttaatgggtatcggtgtgtcatctggtgaaaacagagcagtcgaa；

gap標準分析序列(seqidno：3)：

aggtcgtttcactggagaagttgaagttatcgaaggtggtttccgtgtaaacggtaaagaaattaaatcattcgatgaaccagatgctggtaaattaccatggggcgatttagatatcgacgtagtattagaatgtactggtttctatactgataaagaaaaagcacaagctcacatcgatgcaggtgctaaaaaagtattaatctccgctccagctaaaggtgatgtaaaaacaatcgtattcaacactaaccatgatacattagatggttcagaaacagttgtttcaggtgcttcttgtactactaactcattagcaccagttgcaaaagttttaagtgacgaattcggtttagttgaaggtttcatgactacaattcacgcttacactggtgaccaaaatacacaagacgcacctcacagaaaaggtgacaaacgtcgtgcacgtgcagcagcagaaaatattattcctaactcaacaggtgctgctaaagctatcggtaaagttattccagaaatcgatggtaaa；

pyrh標準分析序列(seqidno：4)：

ttgaatatgtgtcaaatgttcatatttaattgcatttgcatcaacttttggatcagctgaataaacaccatctacattatttttacccattaaaattacatctgcttctacttcagccgcacgtaaagcagcagttgtgtcagttgagaagtaaggattaccaattccagcggcaaatataacaacacgttttttctccaaatgtctaattgcacgtcgacgaatatatggttcagcaacttgtttcatttcaatagaagttaaaacacgtgtatcacaatctaattgttctaaactgtcttgtaatgctaaagcattcattacagtagcaagcatccccatgtaatcagccgtaccacgatccatacctaggtcgctaccagttttgcctctccaaatatttccaccgccgacaatgacagcaatttcacaatccattttggcaacttcagcaacttgctgtgcaacgctttt；

rpob標準分析序列(seqidno：5)：

taacaagtaccagagtttgaacgcttgaatttcgctaaaggataacgatctaattcaccttcatgctcagttccattttcttcaactaaacgacgaactaaaatttcattagattcaacatgttcaacgcgccctctatgcttagcagtgattgcagcaccagagtctcttgcggctacatgttccatacctgtacccacaaatggagcttcaggattcattaaaggcactgcttgacgttgcatgtttgctcccattaacgcacggttagagtcgtcattttctaagaatggaatacatgctgttgctgctgaaacaacttgttttggtgaaacgtccatgtaatccattttctctttagccataacagtgttattaccacggaaacgacaaacaacttcatcatctaagaaacgtccattttcatcaagtctagaattagcctgtgcaacaacgtagctatcctcttcatcagctgtcaaataatctatttgatcggtgattgagtttgtatctaaatccactttacgatatgg；

tufa標準分析序列(seqidno：6)：

cccaggtgacgatgtacctgtaatcgctggttctgcattaaaagcattagaaggcgatgctgaatacgaacaaaaaatcttagacttaatgcaagcagttgatgattacattccaactccagaacgtgattctgacaaaccattcatgatgccagttgaggacgtattctcaatcactggtcgtggtactgttgctacaggccgtgttgaacgtggtcaaatcaaagttggtgaagaagttgaaatcatcggtatgcatgaaacttc---taaaacaactgttactggtgtagaaatgttccgtaagttattagactacgctgaagctggtgacaacatcggtgctttattacgtggtgttgcacgtgaagacgtacaacgtggtcaagtattagctgctcctggttctattacaccacacacaaaattcaaagctgaagtatacgtattatctaaagatgaaggtggacgtcacactccattcttcactaactatcgccc。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明采用以上優化方案，優選6個靶基因，基于靶基因的單核苷酸多態性建立了葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型一體化方法，該方法可對國內常見的葡萄球菌種能夠快速有效的鑒定，鑒定同時能夠進行菌株分型。本發明所述的葡萄球菌鑒定及分型的一體化方法，具有通用性高、鑒定準確和分辯力強等優點，且通量高、操作簡單、快速有效。解決了現有分型方法需在菌株鑒定的基礎上才能實現菌株分型的弊端，實現了葡萄球菌種水平鑒定和分型的一體化，降低了試驗成本，提高了工作效率，結果判定方便準確，更加具有實用性。

本發明所述的葡萄球菌鑒定分型一體檢測鑒定方法提供了新的技術平臺，可用于藥品質量監管部門、藥品生產企業，對藥品、生產和檢驗環境中污染葡萄球菌的種水平鑒定和菌株分型溯源，具有廣闊市場前景和較大的經濟、社會效益。

附圖說明

圖1是靶基因pcr擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜；

圖2是172株葡萄球菌6個靶基因串聯標準序列聚類分析圖。

具體實施方式

本發明提供了一種用于葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的靶基因及其對應的引物序列，以及葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型一體化方法。

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護范圍。

本發明使用的葡萄球菌菌株包含國內常見的18種葡萄球菌，具體菌株信息如表1所示。共172株葡萄球菌，分別來自于國家權威微生物菌種保藏中心，及經過明確鑒定的微生物檢驗實驗室。為保證菌株信息的準確性，我們分別使用16srrna序列比對和全自動微生物生化鑒定系統vitek2.0compact，對菌株信息進行了再確認。

實施例1

本實施例為用于葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的靶基因pcr擴增方法的建立，其包括如下步驟：

步驟一：篩選葡萄球菌屬具有單核苷酸多態性的持家基因；

從ncbigenome網站下載57株高質量的代表性葡萄球菌全基因組核酸序列，涵蓋28個葡萄球菌種，進行葡萄球菌泛基因組學分析。其中，以氨基酸序列作為分析對象，選擇orthomcl軟件進行泛基因組學分析，利用mysql軟件進行數據管理，采用mcl軟件算法進行序列之間的比對分析。通過以下篩選條件的設置：1)核心基因(coregenes)，在所有葡萄球菌菌株中都具有的基因，2)靶基因編碼的氨基酸序列在葡萄球菌之間的同源性大于50％，提供一定的保守性和足夠的變異性，以區分不同的葡萄球菌菌株，3)靶基因在葡萄球菌基因組中必須是單拷貝基因，保證基因的唯一性，4)氨基酸序列長度大于200個氨基酸，便于設計引物并提供足夠的序列多樣性。通過對葡萄球菌泛基因組學數據進行整理，篩選出具有單核苷酸多態性的葡萄球菌持家基因序列。利用軟件mega7.0進行氨基酸序列的比對分析，按同源性從高到低逐一進行序列分析。首先剔除有明顯片段缺失和沒有明顯保守區段的氨基酸靶序列。然后再針對篩選出的氨基酸靶序列的核酸序列進行比對分析，剔除沒有明顯保守區段的靶基因序列，最后篩選出具有單核苷酸多態性特征的葡萄球菌持家基因。

步驟二：靶基因pcr擴增方法的評價；

靶基因pcr擴增引物設計：靶基因核酸序列比對分析后，盡量避開單核苷酸多態性位點，選擇保守核酸序列區域，利用引物設計軟件primer5.0，針對篩選出的靶基因設計多對pcr擴增引物。

靶基因pcr擴增有效性評價：選擇表1中的172株葡萄球菌，提取dna后，在優化的退火溫度下，采用seqidno：1-seqidno：12的引物對分別對候選靶基因的pcr擴增，驗證靶基因pcr擴增引物的有效性和通用性。瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr擴增產物，陽性pcr擴增產物進行核酸測序。對測序后獲得的靶基因序列進行分析，進一步判定pcr擴增的準確性。

表1.172株葡萄球菌菌株信息表

如圖1所示，結果表明候選靶基因fema，ftsz，gap，pyrh，rpob和tufa的pcr擴增引物，在172株葡萄球菌中都能夠進行有效pcr擴增(圖1)，且核酸測序結果表明6個靶基因的pcr擴增序列與目標序列一致。以上結果表明，針對具有單核苷酸多態性的靶基因fema，ftsz，gap，pyrh，rpob和tufa，成功建立了pcr擴增方法，且靶基因pcr擴增引物在葡萄球菌中具有非常好的擴增效率和適用性。

上述pcr反應體系如下：采用20.0μl的反應體系，其中包括：takara2×premix預混液12.5μl，上下游引物(10μmol/l)各1.0μl，菌株dna模板2.0μl，使用滅菌ddh2o水補足20.0μl。

上述pcr反應循環參數如下：

fema:95℃預變性5min，95℃預變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

ftsz:95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

gap:95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

pyrh:95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

rpob:95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min；

tufa:95℃預變性5min，95℃預變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環，最后72℃延伸10min。

實施例2

本實施例為葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型方法的建立，其包括如下步驟：

步驟一：靶基因序列標準化及多樣性分析；

對實施例1中獲取得172株葡萄球菌中6個靶基因的核酸序列，利用軟件mega7.0進行比對分析，去除兩端準確度較低的核酸序列，在snp多態性豐富的區域定義每個靶基因的標準分析序列(約500bp)，其序列為seqidno：1-seqidno：6所示序列。

利用軟件dnasp5.0分析每個靶基因標準序列的多樣性，分別從等位基因(alleles)數目、snp位點數、nucleotidediversity(π)和allelicdiversity(hd)等方面，評價靶基因在不同葡萄球菌之間的序列多樣性(如表2所示)。

6個靶基因在172株菌中的等位基因數目分別為fema(53)，ftsz(50)，gap(51)，pyrh(48)，rpob(56)和tufa(41)，snp位點在每個靶基因中的比率都達到了30％以上，其中靶基因fema的snp位點數最多，占到了60％以上。綜合以上分析結果，本發明篩選的靶基因標準序列在不同葡萄球菌之間具有較好的多樣性，提供了區分不同葡萄球菌菌株的能力。

步驟二：建立葡萄球菌鑒定和分型方法；

本發明選取每個菌株6個靶基因的標準序列，按照fema-ftsz-gap-pyrh-rpob-tufa順序進行標準序列的串聯，串聯后利用mega7.0進行比對分析。將定性判斷為葡萄球菌的靶基因pcr產物進行序列測定，并將其與對應靶基因的標準序列進行比對分析，截取片段大小一致的序列；利用上述截取的序列按fema-ftsz-gap-pyrh-rpob-tufa順序進行序列串聯。

基于序列比對結果，對所得的待檢測菌株的串聯序列與葡萄球菌菌種數據庫中的標準菌株串聯序列，選用鄰接法(neighbor-joiningmethod)和bootstrapmethod(1000)方法進行聚類分析，其結果如圖2和表2所示。

表2.172株葡萄球菌菌種鑒定與分型結果

由如圖2所示，對屬于同一個葡萄球菌種的菌株標記為同一種顏色符號。聚類結果表明，本發明建立的基于單核苷酸多態性分析的葡萄球菌種水平鑒定和分型一體化方法，可以準確的把172株葡萄球菌鑒定為18個種，區分為95個序列型，其結果如表2所示。

由上述結果分析可知本發明依據172株葡萄球菌的鑒定和分型結果，建立葡萄球菌靶基因標準序列及串聯序列數據庫，用于鑒定待檢葡萄球菌，并對葡萄球菌菌株進行分型溯源。

由上述實施例可知，解決了現有分型方法需在菌株鑒定的基礎上才能實現菌株分型的弊端，實現了葡萄球菌種水平鑒定和菌株分型的一體化，降低了試驗成本，提高了工作效率，結果判定方便準確，更加具有實用性

以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。

sequencelisting

<110>上海市食品藥品檢驗所

<120>一種基于單核苷酸多態性的葡萄球菌種鑒定和菌株分型一體化方法

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>498

<212>dna

<213>fema標準分析序列

<400>1

tcttcggcatcttcactaaagtcaccactaataccatagaaattataccgatcaatacca60

tgttcaattgcatagttaatcatcttccattgaaccgcatagctccctgcaaaatggcga120

taacgatttgaagttccaccagcgtagtaaactacttcaaacggattgattataaagaag180

ccagcagagatgggtaattcattgccatgttcttgttttaagtttttggcttcattaatt240

ttttgctggtttgcatcaagttgttgttctaaattttcttttttgttatgtgctttttta300

ttctctggacgcttctcaatgtcttttaaagctttattataatctttattaagcacattt360

ctttcattatttagttcctctatgtactcatcgaagttaatataggctagtggtactaaa420

acacggtctttatagtgtttgaatctgttgtaataaaaactatcatctctatctgcaaaa480

tctttagtttcagaggta498

<210>2

<211>522

<212>dna

<213>ftsz標準分析序列

<400>2

acacgtggattaggtgctggtgctaatcctgaaattggaaagaaagcagcagaagaatca60

agagaacaaattgaagatgctatccaaggtgctgatatggtattcgtaactgctggtatg120

ggtggcggtactggaacaggtgctgcgccggttgttgctaaaattgcaaaagaaatgggt180

gctttaactgtaggtgttgttacgcgtccattcggtttcgaaggtcgtaagcgccaaaca240

caagcggcagctggtgtagaatctatgaaagcagcagtggatacattaattgttattcca300

aatgatcgcttattagatatcgttgacaaatctacgccgatgatggaagcatttaaagaa360

gcggataatgtattacgtcaaggtgtacaaggtatttcagatttaattgcagtatcaggt420

gaagtgaacttagactttgcagacgttaaaacaattatgtctaatcaaggttctgcgtta480

atgggtatcggtgtgtcatctggtgaaaacagagcagtcgaa522

<210>3

<211>529

<212>dna

<213>gap標準分析序列

<400>3

aggtcgtttcactggagaagttgaagttatcgaaggtggtttccgtgtaaacggtaaaga60

aattaaatcattcgatgaaccagatgctggtaaattaccatggggcgatttagatatcga120

cgtagtattagaatgtactggtttctatactgataaagaaaaagcacaagctcacatcga180

tgcaggtgctaaaaaagtattaatctccgctccagctaaaggtgatgtaaaaacaatcgt240

attcaacactaaccatgatacattagatggttcagaaacagttgtttcaggtgcttcttg300

tactactaactcattagcaccagttgcaaaagttttaagtgacgaattcggtttagttga360

aggtttcatgactacaattcacgcttacactggtgaccaaaatacacaagacgcacctca420

cagaaaaggtgacaaacgtcgtgcacgtgcagcagcagaaaatattattcctaactcaac480

aggtgctgctaaagctatcggtaaagttattccagaaatcgatggtaaa529

<210>4

<211>474

<212>dna

<213>pyrh標準分析序列

<400>4

ttgaatatgtgtcaaatgttcatatttaattgcatttgcatcaacttttggatcagctga60

ataaacaccatctacattatttttacccattaaaattacatctgcttctacttcagccgc120

acgtaaagcagcagttgtgtcagttgagaagtaaggattaccaattccagcggcaaatat180

aacaacacgttttttctccaaatgtctaattgcacgtcgacgaatatatggttcagcaac240

ttgtttcatttcaatagaagttaaaacacgtgtatcacaatctaattgttctaaactgtc300

ttgtaatgctaaagcattcattacagtagcaagcatccccatgtaatcagccgtaccacg360

atccatacctaggtcgctaccagttttgcctctccaaatatttccaccgccgacaatgac420

agcaatttcacaatccattttggcaacttcagcaacttgctgtgcaacgctttt474

<210>5

<211>536

<212>dna

<213>rpob標準分析序列

<400>5

taacaagtaccagagtttgaacgcttgaatttcgctaaaggataacgatctaattcacct60

tcatgctcagttccattttcttcaactaaacgacgaactaaaatttcattagattcaaca120

tgttcaacgcgccctctatgcttagcagtgattgcagcaccagagtctcttgcggctaca180

tgttccatacctgtacccacaaatggagcttcaggattcattaaaggcactgcttgacgt240

tgcatgtttgctcccattaacgcacggttagagtcgtcattttctaagaatggaatacat300

gctgttgctgctgaaacaacttgttttggtgaaacgtccatgtaatccattttctcttta360

gccataacagtgttattaccacggaaacgacaaacaacttcatcatctaagaaacgtcca420

ttttcatcaagtctagaattagcctgtgcaacaacgtagctatcctcttcatcagctgtc480

aaataatctatttgatcggtgattgagtttgtatctaaatccactttacgatatgg536

<210>6

<211>498

<212>dna

<213>tufa標準分析序列

<400>6

cccaggtgacgatgtacctgtaatcgctggttctgcattaaaagcattagaaggcgatgc60

tgaatacgaacaaaaaatcttagacttaatgcaagcagttgatgattacattccaactcc120

agaacgtgattctgacaaaccattcatgatgccagttgaggacgtattctcaatcactgg180

tcgtggtactgttgctacaggccgtgttgaacgtggtcaaatcaaagttggtgaagaagt240

tgaaatcatcggtatgcatgaaacttctaaaacaactgttactggtgtagaaatgttccg300

taagttattagactacgctgaagctggtgacaacatcggtgctttattacgtggtgttgc360

acgtgaagacgtacaacgtggtcaagtattagctgctcctggttctattacaccacacac420

aaaattcaaagctgaagtatacgtattatctaaagatgaaggtggacgtcacactccatt480

cttcactaactatcgccc498

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>fema-f

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>yiscort

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>risaorg

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>yiscort

<400>7

taayaaartcaccaacataytc22

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>fema-r

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>yiscort

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>misaorc

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>nisa,c,g,ort

<400>8

tymgntcatttatggaagatac22

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>ftsz-f

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>bisg,t,orc

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>disg,a,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>yiscort

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>disg,a,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>risaorg

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>yiscort

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>yiscort

<400>9

gcbacdytdaargtyatygg20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>ftsz-r

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>risaorg

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>wisaort

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>risaorg

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>disg,aort

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>wisaort

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>hisa,torc

<400>10

ttrtcwtcraadccwgthgc20

<210>11

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gap-f

<400>11

atggttttggtagaattggtcgttta26

<210>12

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gap-r

<400>12

gacatttcgttatcataccaagctg25

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pyrh-f

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>yiscort

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>disg,aort

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>yiscort

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>hisa,torc

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>disg,aort

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>yiscort

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>misaorc

<400>13

aytdagygghgaagcdytmg20

<210>14

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pyrh-r

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>risaorg

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>nisa,c,g,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>nisa,c,g,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>hisa,torc

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>wisaort

<400>14

agaargangangchgtwga19

<210>15

<211>17

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>rpob-f

<400>15

caattcatggaccaagc17

<210>16

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>rpob-r

<400>16

ccgtcccaagtcatgaaac19

<210>17

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>tufa-f

<400>17

ccaatgccacaaactcgt18

<210>18

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>tufa-r

<400>18

cctgaaccaacagtacgt18