提高大腸桿菌甲醇代謝途徑中限速酶活性的方法與流程

本發明涉及大腸桿菌甲醇代謝途徑的組裝與調控，具體涉及一種增強甲醇代謝通路中限速酶甲醇脫氫酶活性的方法，從而提高甲醇在大腸桿菌中的代謝量。
背景技術：
：隨著代謝工程的迅猛發展及生物合成學的崛起，人類改造微生物作為細胞工廠進行生物制造的能力顯著提高。當前生物制造的原料仍以糧食為主，隨著糧食危機日益家具以及其價格不斷攀升，以糧食為原料的生物制造正面臨嚴峻考驗。因此，為了解決原料來源問題，實現生物制造可持續發展，目前逐漸將“甲醇經濟”發展為合理的可替代能源——以甲醇為原料，緩解化石能源的緊缺。與其他原料相比，甲醇具備以下優勢：1)價格低廉，當前甲醇的價格是葡萄糖價格的1/3；2)來源廣泛，從天然氣、煤化工、生物質等均可合成；3)含能高，為目標產物的合成提供充足還原力。因此，以甲醇替代糧食作為原料，可以大幅度降低生物制造的而成本，實現生物制造的可持續發展。自然界中存在能夠代謝甲醇的微生物，如甲基桿菌(methylobacteriumextorquens)、甲醇芽孢桿菌(bacillusmethanolicus)、甲醇營養型酵母(methylotrophicyeasts)等。盡管這些微生物可以利用甲醇作為原料，但其利用效率較低，究其原因，一方面是大部分的甲醇營養菌是好氧型，另一方面，菌株遺傳操作低效落后。故，在模式菌株中構建甲醇代謝途徑是實現甲醇高效生物轉化的有效途徑。在甲醇營養菌株中，甲醇經甲醇脫氫酶(mdh)氧化為甲醛，后經過磷酸核酮糖途徑(rump途徑)完成中心糖代謝。其中，甲醇代謝的rump途徑由兩個模塊組成，第1模塊由異源基因組成，第2模塊由內源磷酸戊糖途徑的相關基因組成。甲醇經第1模塊中的甲醇脫氫酶作用氧化為甲醛，與第2模塊中的5-磷酸核酮糖一起經第1模塊生成6-磷酸果糖，進而部分通過模塊1流向糖酵解路徑生成產品，另一部分通過模塊2再生5-磷酸核酮糖促進甲醛同化。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種提高大腸桿菌甲醇代謝途徑中限速酶活性的方法，來提高菌株對甲醇利用率。為實現上述技術目的，本發明采用如下技術方案：一種提高大腸桿菌甲醇代謝途徑中限速酶活性的方法，將大腸桿菌過表達基因mdh和hps-phi后，通過添加激活蛋白nudf，增強甲醇脫氫酶的酶活，從而提高甲醇的代謝量；其中，所述基因mdh和hps-phi為來源于甲醇芽孢桿菌mga3的mdh2和hps-phi；所述激活蛋白nudf來源于e.colimg1655。本發明所述的方法，其具體包括如下步驟：(1)將來源于甲醇芽孢桿菌mga3的mdh2和hps-phi，合成基因后通過基因克隆至質粒petduet，構建得到質粒petduet-mdh2-rump；(2)將質粒petduet-mdh2-rump導入大腸桿菌bl21(de3)，獲得菌株bl21(de3)/petduet-mdh2-rump；(3)添加來源于e.colimg1655的同源激活蛋白nudf，構建菌株bl21(de3)/petduet-nudf-mdh2-rump。本發明的另一目的在于提供上述方法制備的菌株。本發明的又一目的在于提供上述方法制備的菌株在甲醇代謝中的應用。上述應用中，采用菌株發酵代謝甲醇，培養基成分為：17.1g/lna2hpo4·12h2o、3g/lkh2po4、10g/lnh4cl、0.5g/lnacl，微量元素；其中添加50mm甲醇和10g/l葡萄糖為混合碳源。優選的，采用菌株發酵代謝甲醇，在培養基中添加有機氮源，所述有機氮源選自為麥芽浸出粉、酵母粉、蛋白胨、玉米漿中的一種，其終濃度均為1g/l。本發明在大腸桿菌中進行甲醇代謝路徑的組裝，實現甲醇代謝，并通過分子手段改造提高甲醇脫氫酶mdh的酶活，以實現甲醇代謝的提高。本發明中高通量篩選甲醇脫氫酶所用培養基為m9培養基，并在其中添加一定量的甲醇，即以葡萄糖和甲醇為混合碳源，通過甲醇轉化為甲醛的量表達甲醇脫氫酶的活力。另本發明中，定量測定甲醇消耗所用的培養基為m9培養基，在搖瓶發酵過程中添加一定量的葡萄糖和甲醇作為碳源，通過檢測甲醇的消耗量表達大腸桿菌內甲醇代謝能力。本發明還對菌株發酵的培養基進行了優化，采用麥芽浸出粉氮源進一步提高了菌株的甲醇代謝效果。附圖說明圖1是甲醛濃度隨時間變化曲線圖；圖2是菌株生長狀況隨時間變化曲線圖；圖3是菌株甲醇消耗量柱形圖；圖4是不同氮源下甲醇消耗量柱形圖。具體實施方式下面結合附圖說明對本發明的具體實施方式做進一步闡述。實施例中選用的載體質粒為petduet，購自寶日醫生物技術公司；所用表達基因的宿主菌為大腸桿菌bl21(de3)，購自北京全式金生物技術有限公司。實施例1：大腸桿菌甲醇代謝路徑組裝本發明在大腸桿菌中組裝依賴nad甲醇脫氫酶和rump途徑的甲醇代謝途徑。通過對比不同來源的甲醇脫氫酶mdh和3-己糖-6-磷酸合酶hps以及3-己糖-6-磷酸異構酶phi，選定來源于甲醇芽孢桿菌(bacillusmethanolicus)mga3的mdh2和hps-phi，合成基因后通過基因克隆至質粒petduet，構建得到質粒petduet-mdh2和質粒petduet-mdh2-rump。將該質粒通過常規方法分別導入大腸桿菌bl21(de3)中，獲得的菌株分別命名為m和mr，并以甘油管形式保存，其中菌株m只過表達基因mdh2，且連接至載體的酶切位點為ncoi和bamhi；菌株mr過表達基因mdh2、hps-phi，且mdh2的酶切位點與上述相同，hps-phi的酶切位點為ndei和xhoi，均以t7為啟動子。實施例2：增強甲醇脫氫酶酶活為了增強甲醇脫氫酶mdh的活力，本實施例中采取了三種方案：方案一為通過定向進化增強甲醇脫氫酶的酶活，但酶活提高不明顯；方案二為通過添加激活蛋白增強甲醇脫氫酶的酶活，其中激活蛋白采用兩種來源：一是添加來源于e.colimg1655的同源激活蛋白nudf，構建成菌株bl21(de3)/petduet-nudf-mdh2和bl21(de3)/petduet-nudf-mdh2-rump，菌株分別命名為nudf-m和nudf-mr；二是添加來源于bacillus.methanolicuspb1異源激活蛋白act，構建成菌株bl21(de3)/petduet-act-mdh2，菌株命名為act-m；方案三為替換甲醇脫氫酶mdh2，替換的甲醇脫氫酶來源于cupriavidusnecatorn-1，且在第26、31、169位點進行點突變，構建成菌株bl21(de3)/petduet-mdh2，菌株命名為mdh2-m。其中添加激活蛋白的目的是促進甲醇脫氫酶mdh的輔因子nadh的氧化，從而提高甲醇脫氫酶mdh的轉化速率。在進行甲醇脫氫酶酶活定量檢測時，以空菌bl21(de3)/petduet為對照，該空菌命名為b。實施例3：甲醇脫氫酶酶活的檢測本發明中檢測甲醇脫氫酶mdh的酶活采用nash試劑(即乙酰丙酮試劑)與甲醛的顯色反應，通過生成的甲醛的量檢測甲醇脫氫酶的活力(即甲醇氧化為甲醛的能力)。m9培養基：17.1g/lna2hpo4·12h2o、3g/lkh2po4、10g/lnh4cl、0.5g/lnacl，微量元素，及10g/lglucose。nash試劑：150g/l醋酸銨、3ml/l乙酸、2ml/l乙酰丙酮。甘油管中菌株接至搖管使菌株復壯，37℃，200rpm，過夜培養，收集菌，5000g，7min離心，m9重懸，轉接至9ml的m9培養基中，添加0.5m甲醇開始反應，不同時間取樣，與nash試劑1:1反應混合，在58℃反應10min，于412nm檢測吸光度，對應標曲計算甲醛濃度。結果如圖1所示，在相同時間90min，添加同源激活蛋白nudf的菌株nudf-m生成0.056mm甲醛，添加異源激活蛋白act的菌株act-m生成0.019mm，而未經改造的菌株m生成甲醛0.014mm，即添加同源激活蛋白nudf的菌株生成甲醛是未經改造菌株生成甲醛的4倍。更直觀地比較甲醇脫氫酶mdh的變化，將定義1u定義為每分鐘生成1μmol甲醛的量，即酶活，酶活結果如表3。表3菌株activity(mu)b0m166.42act-m219.29nudf-m593.25實施例4：甲醇代謝菌株搖瓶發酵m9培養基：17.1g/lna2hpo4·12h2o、3g/lkh2po4、10g/lnh4cl、0.5g/lnacl，微量元素。本實施例中，定量檢測甲醇消耗采用搖瓶發酵，以m9培養基添加50mm甲醇和10g/l葡萄糖為混合碳源，其步驟具體如下：將上述實施例1、2構建的菌株b、mr、nudf-mr在lb種子培養液中過夜培養，檢測其od600，轉接至50mlm9培養基中，且該培養基中葡萄糖濃度為10g/l，使其初始od600為0.3，取其相應的種子液，5000rpm，離心7min，于無菌條件下棄上清液，用發酵培養基重懸轉接至搖瓶，于37℃，200rpm恒溫培養搖床培養4小時左右，加入0.5mmiptg和50mm甲醇，于一定時間取樣測其od600以及檢測甲醇的量。菌株生長狀況結果如圖2所示，在添加50mm甲醇后，一定時間采用分光光度計檢測菌株在od為600nm處的生長狀況，在0-11h時，為三菌株的延滯期；11-24h，為菌株的指數生長期；24-36h，為菌株的穩定期。三株菌的生長趨勢相似，在11h左右，添加激活蛋白的菌株與對照菌株及未添加激活蛋白的菌株相比，生長狀況較佳，故添加激活蛋白的菌株在含甲醇的培養基中生長并未產生不佳影響。甲醇消耗結果如圖3所示，在甲醇添加量為3g/l時，與對照菌株b相比，未添加激活代表的菌株mr甲醇消耗為0.36g/l，添加激活蛋白后的菌株nudf-mr甲醇消耗為0.57g/l，即大腸桿菌內甲醇代謝路徑組裝后甲醇有消耗，且在添加同源激活蛋白提高限速酶的酶活后，甲醇代謝量得以提高約1.5倍。實施例5：搖瓶發酵培養基的優化通過實施例4中的結果顯示，菌株nudf-mr的甲醇代謝量最佳，以該菌株為基礎，將實施例4中的發酵培養基m9培養基添加不同的有機氮源，分別為麥芽浸出粉、酵母粉、蛋白胨、玉米漿，其終濃度均為1g/l。按照實施例4中的發酵方法，在一定時間檢測甲醇的代謝量。結果如圖4顯示，通過添加不同的無機氮源，定量檢測甲醇消耗，以確定最佳的發酵條件。結果顯示，添加1g/l麥芽浸出粉時，甲醇的消耗量為最高，約為0.6g/l，而最新報道在添加酵母粉的條件下，搖瓶發酵甲醇消耗約為0.3g/l。當前第1頁12