本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法及其應用。
背景技術：
：誘導多能干細胞(inducedpluripotentstemcells,ipscells)最初是日本人山中申彌(shinyayamanaka)于2006年利用病毒載體將四個轉錄因(oct4,sox2,klf4和c-myc)的組合轉入分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種細胞類型。ips細胞不僅可用于分化和移植，還可以提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發新的治療方法。人類ips細胞的建立被公認為2007年最重要的科技進展之一，這項技術不僅可以從體細胞建立個體特異的多能干細胞系，解決了細胞移植治療中的免疫排斥問題，而且為研究人類細胞的重編程的機理以及研究個體特異的疾病發生機理提供了有力的方法。在體外，ips細胞可定向誘導分化出多種細胞，比如神經干細胞、肝臟干細胞、心肌干細胞等，因此，ips細胞在理論研究和臨床應用等方面都極具應用價值。在誘導多能干細胞增殖分化過程中會分泌出多種生長因子、蛋白質、活性多肽、微量元素等促進細胞生長、活化、再生等的物質。雖然誘導多能干細胞分泌素的市場潛力很大，但其大量培養存在著較大困難，目前報道尚未多見。中國專利cn102732586b公開了一種間充質干細胞分泌素的制備方法，所述制備方法包括細胞培養，分泌素溶液收集培養，純化，濃縮，利用了生物反應器技術替代傳統的細胞培養瓶去制作間充質干細胞分泌素，大幅縮減成本及所需空間，提高了充質干細胞細胞分泌素的產量。中國專利申請cn101461772a公開了用于美容護膚的干細胞分泌因子的制備方法，所述制備方法包括細胞分離、干細胞擴增、干細胞因子體系的獲取和濃縮、貯存，該發明簡單易行，適宜大規模生產。技術實現要素：為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法及其應用。本發明提供的誘導多能干細胞分泌素的制備方法簡單易行，適宜大規模生產，有效提高了誘導多能干細胞分泌素的產量。本發明提供了一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法，包括以下步驟：s1重懸誘導多能干細胞，得誘導多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應器的誘導多能干細胞培養液中，在37℃、5％co2條件下培養24-72h，得誘導多能干細胞；s3在步驟s2中誘導多能干細胞分裂旺盛階段，用磷酸緩沖液沖洗誘導多能干細胞和三維載體2-4次，然后向生物反應器中加入基礎培養液imdm/f12與磷酸緩沖液繼續培養6-24h，收集生物反應器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，濃縮，即得。本發明誘導多能干細胞分泌素通過超膜過濾，截留分子量為30kd，濃縮后所得的多種生命活性物，其包括蛋白質、多肽及生物活性因子等多種成分。誘導多能干細胞分泌素中的多種生命活性成分具有復雜的生理作用，每種成分都可以對許多組織器官產生影響，同時每種形式生理機能的提高也不是單一因子的作用，而是需要多種因子的相互協調作用。該分泌物具有促進細胞增殖、分化、凋零，防止細胞衰老，參與免疫調節，抗氧化等作用。進一步地，所述步驟s2中細胞培養基包括基礎培養基imdm/f12和添加劑；其中，添加劑為2-4mg/ml人白蛋白、40-60μg/ml維生素c和3-7mg/ml人參皂苷單體rb1。人參皂苷單體rb1可以顯著提高誘導多能干細胞誘導效率，并可以顯著延緩細胞的衰老和促進細胞的增殖。進一步地，所述步驟s2中細胞培養基由基礎培養基imdm/f12和添加劑組成；其中，添加劑為3mg/ml人白蛋白、50μg/ml維生素c和5mg/ml人參皂苷單體rb1。進一步地，所述步驟s2中誘導多能干細胞密度為1×108-1×109個/l。進一步地，所述步驟s3中基礎培養液imdm/f12與磷酸緩沖液的體積比為1:(2-6)。進一步地，所述步驟s3中磷酸緩沖液的濃度為0.01m，ph值為7.3。進一步地，所述步驟s4中濃縮方式為通過切向流過中控纖維超濾柱，體積濃縮1/8。同時，本發明制得的誘導多能干細胞分泌素可用于保健品或化妝品中。與現有技術相比，本發明提供的誘導多能干細胞分泌素的制備方法簡單易行，適宜大規模生產，有效提高了誘導多能干細胞分泌素的產量，且在抗衰老、抑制黑色素及修復受損細胞的應用中效果較好。具體實施方式下面通過具體實施例對本發明做進一步說明，這些實施例僅用于例證的目的，并不限制于本發明的保護范圍。實施例1一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導多能干細胞，得誘導多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應器的誘導多能干細胞培養液imdm/f12+2mg/ml人白蛋白+40μg/ml維生素c+3mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養24h，得誘導多能干細胞；s3在步驟s2中誘導多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導多能干細胞和三維載體2次，然后向生物反應器中加入基礎培養液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:2)繼續培養6h，收集生物反應器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。實施例2一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導多能干細胞，得誘導多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應器的誘導多能干細胞培養液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+50μg/ml維生素c+5mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養48h，得誘導多能干細胞；s3在步驟s2中誘導多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應器中加入基礎培養液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:4)繼續培養15h，收集生物反應器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。實施例3一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導多能干細胞，得誘導多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應器的誘導多能干細胞培養液imdm/f12+4mg/ml人白蛋白+60μg/ml維生素c+7mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養72h，得誘導多能干細胞；s3在步驟s2中誘導多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應器中加入基礎培養液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:6)繼續培養24h，收集生物反應器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。對比例1一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導多能干細胞，得誘導多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應器的誘導多能干細胞培養液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+5.05mg/ml維生素c中，在37℃、5％co2條件下培養48h，得誘導多能干細胞；s3在步驟s2中誘導多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應器中加入基礎培養液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:4)繼續培養15h，收集生物反應器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。與實施例2的區別在于，步驟s2中誘導多能干細胞培養液里未添加人參皂苷單體rb1，增加了維生素c的用量。對比例2一種誘導多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導多能干細胞，得誘導多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應器的誘導多能干細胞培養液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+50μg/ml維生素c+5mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養48h，得誘導多能干細胞；s3在步驟s2中誘導多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應器中加入基礎培養液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:4)繼續培養15h，收集生物反應器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，常規濃縮1/8，即得。與實施例2的區別在于，將步驟s4中通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮替換為常規濃縮。試驗例一、體外抗衰老試驗1.試驗材料：實施例1-3及對比例1-2制備的誘導多能干細胞分泌物。2.試驗方法：取人皮膚成纖維母細胞(hdf細胞)，用含10％(v/v)fbs的dmem/f12培養基配制hdf細胞懸液，得到4×104cell/ml細胞懸液，分別注入3塊96孔培養板內，每孔100μl，每處理組別設復孔4孔，置于含5％(v/v)co2、37℃的恒溫培養箱內培養24h。24h后棄原培養液，分別加入含1μg/ml的誘導多能干細胞分泌物的1640培養液100μl，設含15％新生牛血清的1640培養液100μl為培養基對照組，設不含有新生牛血清的1640培養液為空白對照組，放入37℃、5％co2培養箱中分別培養24h、72h、120h、168h。各觀察期終止時，加入20μl/孔的mtt液，繼續培養6h，吸去原液，加入150μl/孔二甲基亞砜。震蕩10min，在免疫酶標儀上以490nm波長測定吸光度。按下列公式計算細胞相對存活率(rgr)：其中0h的細胞活力作為100％。3.試驗結果：誘導多能干細胞分泌物對hdf細胞相對存活率的影響結果見表1。表1誘導多能干細胞分泌物對hdf細胞相對存活率的影響由表1可知，本發明制備的誘導多能干細胞分泌物對hdf細胞作用24-168h，沒有細胞毒性作用，反而具有促進hdf細胞增殖的作用。與對比例1-2相比，本發明制備的誘導多能干細胞分泌物對hdf的生長的促進作用較明顯且在120h時達到高峰，說明本發明提供的誘導多能干細胞分泌物的制備方法較好，且本發明制備的誘導多能干細胞分泌物不會對細胞產生不正常的增生，對人體的使用安全性高。試驗例二、黑色素生成抑制效果試驗1.試驗材料：實施例1-3及對比例1-2制備的誘導多能干細胞分泌物。2.試驗方法：使用小鼠惡性黑色素瘤細胞。使用含有胎牛血清10％的eagle’smem培養基)，在co2培養箱(5％co2、37℃)內培養。將小鼠惡性黑色素瘤細胞制成細胞濃度3×105個/ml的懸浮液，將該懸浮液1ml注入含有培養基9ml的100mm培養皿中。第二天替換為分別含有1μg/ml的誘導多能干細胞分泌物的培養基，培養4天。培養結束后，刮取細胞，各組的細胞數總計為5×106個，進行離心。添加1mol/lnaoh500ml溶解后，測定其溶解液405nm處的吸光度。將無添加組作為100％，計算各組的黑素生成抑制率。3.試驗結果：黑素生成抑制率結果如表2所示。表2黑色素生成抑制結果組別實施例1組實施例2組實施例3組對比例1組對比例2組抑制率/％57.862.052.746.543.1由表2可知，本發明制備的誘導多能干細胞分泌物能有效抑制黑色素生成，具有良好的美白效果。與對比例1-2相比，本發明實施例1-3制備的誘導多能干細胞分泌物抑制黑色素生成的效果較好，說明本發明的誘導多能干細胞分泌物制備方法制得的誘導多能干細胞分泌物中抑制黑色素生成的有效成分含量較多。試驗例三、對紫外照射后細胞的修復作用用含10％(v/v)fbs的dmem/f12培養基(青霉素200u/ml、鏈霉素200u/ml，ph＝7.2)培養人包皮成纖維細胞(hff，atcc)至融合度為80％左右時，換用含1％(v/v)fbs的1640培養基，每天在紫外線下照射2h。陰性對照組用錫紙包住細胞培養瓶。細胞照射完四天后，觀察發現細胞開始出現皺縮，開始有個別的細胞漂浮在培養基中。第五天，用含1％(v/v)fbs的1640培養基稀釋各樣品，誘導多能干細胞分泌物高劑量組終濃度為100μg/ml，低劑量終濃度為1μg/ml；陽性對照組(即紫外照射后不加提取物)加入含1％(v/v)fbs的1640培養基。繼續培養24h，觀察細胞形態。結果表明，本發明制備的誘導多能干細胞分泌物對紫外照射造成的細胞損傷具有顯著的修復作用。由以上試驗可知，本發明制備的誘導多能干細胞分泌物對人體安全，且能夠抗衰老、抑制黑色素的生成及修復受損細胞等，可用于保健品或化妝品中。上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術領域：
中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。當前第1頁12