一株耐受納米二氧化鈦毒性的施氏假單胞菌及其應用的制作方法

本發明涉及一種施氏假單胞菌，特別是涉及一種在好氧條件下能夠耐受納米二氧化鈦毒性且能夠將廢水中的硝酸鹽氮同步脫除的施氏假單胞菌及其在污水處理中的應用。

背景技術：

納米材料的粒徑一般介于1-100nm之間，因其特殊的物理化學特性(如非遷移性、熒光性、壓電性和散射紫外線能力等)以及其在光、電、磁等方面的奇妙性能，被廣泛用于藥物、化妝品、殺菌防腐、復合材料、食品抗菌包裝膜、再生醫學、醫療器械等領域。納米tio2是目前使用最廣泛的金屬氧化物納米顆粒，據統計tio2每年全球生產總量達10000噸，約50-80％的納米tio2被用于化妝品和防曬產品。隨著納米tio2的工業化生產和廣泛應用，其不可避免地排入污水收集系統，并最終隨著生活污水和工業廢水系統進入污水處理廠。

眾所周知，國內外城市污水處理廠普遍采用活性污泥法來實現污水氮和磷的去除。在活性污泥處理系統中，以微生物為核心的活性污泥是污染物的重要分解者，其生長和代謝水平的高低將直接影響污水處理的效果。研究表明，納米材料的存在會顯著抑制活性污泥中微生物尤其是脫氮微生物的生長代謝，從而會影響污水的脫氮效果，對污水處理廠的穩定運行帶來潛在危害。

目前緩解或消減納米材料對生物脫氮系統的影響主要有兩種方式。一種是通過通過改變納米材料的結構特性來實現。然而，納米材料的摻雜或改性會改變納米材料自身的特性，這對納米材料的應用范圍會產生一定的影響。另一種方式是發現和培殖具有納米材料耐受能力的功能微生物，這種方式不改變納米材料的特性，且會使整個污水生物處理系統具有較好的處理效果和較強的抗沖擊能力，是一種較為可行的方法，但是在實際應用過程中，符合條件的微生物較為稀少，難以滿足日益增長的現實需要。

因此，發明人考慮，如果能夠篩選出抵抗納米材料生物毒性能力脫氮功能菌，其應用將會有效削減納米材料對污水生物脫氮過程的潛在風險。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種耐受納米二氧化鈦的高效好氧脫氮菌株，通過該菌株強化污水處理系統的生物脫氮效果，以削減納米二氧化鈦的存在對污水處理生物脫氮過程的影響。

本發明所提供的菌株，為一株施氏假單胞菌(p.stutzeri)，是一株具有在單一好氧環境中實現硝酸鹽氮高效去除能力的好氧反硝化細菌。

本發明通過下述技術方案予以實現：

本發明提供的具有納米二氧化碳耐受能力的施氏假單胞菌(pseudomonasstutzeri)，于2017年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，，其保藏號為cgmccno.14062。

如上所述的施氏假單胞菌(p.stutzeri)，其特征在于廢水中存在納米二氧化鈦的條件下，納米顆粒會吸附在菌體表面，菌株p.stutzeri能夠保持完整的細胞結構，細胞膜不被破壞。

如上所述的施氏假單胞菌(p.stutzeri)，其特征在于廢水中存在低濃度水平的納米二氧化鈦的條件下(<4mg/l)，該菌株能夠以硝酸鹽氮為唯一氮源，在好氧環境下硝酸鹽氮的去除率可達100％，總氮的去除率可達85％以上。

如上所述的施氏假單胞菌(p.stutzeri)，其特征在于廢水中存在低濃度水平的納米二氧化鈦的條件下(4-128mg/l)，該菌株能夠以硝酸鹽氮為唯一氮源，在好氧環境下硝酸鹽氮的去除率可達100％，總氮的去除率同樣可達100％。

本發明的施氏假單胞菌及其應用與現有技術相比較有如下有益效果：

(1)根據發現的施氏假單胞獨特的生理特征，實現了對納米二氧化鈦毒性的耐受，解決了納米材料的存在對生物脫氮過程的潛在影響。

(2)采用本發明，通過將該菌株接種到傳統活性污泥法的二級生化處理系統，在納米氧化鋅濃度為0～150mg/l存在條件下，優選的，在0～128mg/l存在條件下，硝酸鹽氮的去除率可達100％，說明菌株具有較強的耐受納米材料毒性和好氧反硝化能力。這種特性使得該菌株在城鎮污水處理系統的實用性大大增強。

(3)本發明便捷靈活，應用前景廣闊，具有很好的社會效益。

下面結合具體實施方式對本發明進行詳細描述。本領域的普通技術人員可以理解，實施例僅僅是舉例說明的目的，本發明的范圍并不以具體實施方法為限，而是由權利要求的范圍加以限定。

附圖說明

圖1：圖1為施氏假單胞菌在納米二氧化鈦存在條件下的掃描電鏡圖像。

圖2：圖2為施氏假單胞菌在1mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性。

圖3：圖3為施氏假單胞菌在4mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性。

圖4：圖4為施氏假單胞菌在16mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性。

圖5：圖5為施氏假單胞菌在64mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性。

圖6：圖6為施氏假單胞菌在128mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性。

具體實施方式

下面結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步詳細描述：

實施例1

一、利用掃描電鏡觀察施氏假單胞菌在納米二氧化鈦存在時的表觀形態

本實驗所用高效好氧反硝化菌株為施氏假單胞菌p.stutzeri，其分離自垃圾填埋場滲濾液處理系統。

將施氏假單胞菌p.stutzeri接種于1l含0.5gkno3和0.35gnh4cl的lb培養基中(每升含nacl5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g)，防止雜菌的侵入及保持菌體的生長活力，進行富集培養。將培養得到的菌液離心，用0.5％的nacl洗滌三次，制成光密度od600為1-2的菌懸液。然后再將菌懸液按10％的接種量接種于含有16mg/l納米tio2的培養基中，8h后取樣在8000rpm和4℃條件下離心5min去除上清液，并用pbs(磷酸鹽緩沖液)清洗兩次。用2.5％戊二醛固定1h，乙醇梯度洗脫后分散在無水乙醇中，取少量滴在硅片上晾干，在掃描電鏡(sem)下觀察細胞形態。

結果如圖1所示，當納米tio2濃度為16mg/l時，菌株p.stutzeri呈現完整和光滑的表面，說明菌株細胞形態對納米tio2具有較強的耐受性。

實施例2

二、施氏假單胞菌在1mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性

將富集培養后的菌懸液按照10％的接種量接種于含有1mg/l納米tio2的bm培養基中，每隔4h取樣2ml，取樣在8000rpm和4℃條件下離心5min，上清液用于各種含氮化合物濃度的測定。反硝化性能測試培養基(bm)配方為每升水中：8.45gch3coona,0.61gnano3,1.76gk2hpo4·3h2o,0.20gmgso4·7h2o,0.02gcacl2,0.005gfeso4·7h2o,0.1ml微量元素溶液。將培養基ph值調至7.5，在121℃滅菌30min。

如圖2所示，當納米納米tio2的濃度為1mg/l時，硝酸鹽氮可以在28h內全部去除。在硝酸鹽氮的去除過程中，伴隨了亞硝酸鹽氮的積累，在16h亞硝酸鹽氮的積累量達到最大，具體數值為65.7mg/l。隨著反應的繼續進行，亞硝酸鹽氮逐漸被施氏假單胞菌所降解，48h后濃度降低至8.0mg/l。以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的綜合代表系統中的總氮，在這一條件下，總氮的去除率可達92.4％，說明菌株實施假單胞菌對納米tio2有較好的耐受性。

實施例3

三、施氏假單胞菌在4mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性

將富集培養后的菌懸液按照10％的接種量接種于含有4mg/l納米tio2的bm培養基中，每隔4h取樣2ml，取樣在8000rpm和4℃條件下離心5min，上清液用于各種含氮化合物濃度的測定。

如圖3所示，當納米tio2的濃度為4mg/l時，硝酸鹽氮可以在28h內全部去除。在硝酸鹽氮的去除過程中，伴隨了亞硝酸鹽氮的積累，在20h亞硝酸鹽氮的積累量達到最大，具體數值為64.8mg/l。隨著反應的繼續進行，亞硝酸鹽氮逐漸被施氏假單胞菌所降解，48h后濃度降低至16.2mg/l。以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的綜合代表系統中的總氮，在這一條件下，總氮的去除率可達84.6％。在此濃度水平下的總氮去除率稍低于納米tio2的濃度水平為1mg/l時的狀況，但菌株施氏假單胞菌還是能夠實現對氮素的高效去除。

實施例4

四、施氏假單胞菌在16mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性

將富集培養后的菌懸液按照10％的接種量接種于含有16mg/l納米tio2的bm培養基中，每隔4h取樣2ml，取樣在8000rpm和4℃條件下離心5min，上清液用于各種含氮化合物濃度的測定。

如圖4所示，當納米tio2的濃度為16mg/l時，硝酸鹽氮可以在20h去除率達100％。在硝酸鹽氮的去除過程中，伴隨了亞硝酸鹽氮的積累，在12h亞硝酸鹽氮的積累量達到最大，具體數值為65.3mg/l。隨著反應的繼續進行，亞硝酸鹽氮逐漸被施氏假單胞菌所降解，48h后亞硝酸鹽被完全去除。以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的綜合代表系統中的總氮，在這一條件下，總氮的去除率可達100％。說明在高濃度水平的納米tio2條件下，菌株施氏假單胞菌對納米tio2具有更強的耐受能力。

實施例5

五、施氏假單胞菌在64mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性

將富集培養后的菌懸液按照10％的接種量接種于含有64mg/l納米tio2的bm培養基中，每隔4h取樣2ml，取樣在8000rpm和4℃條件下離心5min，上清液用于各種含氮化合物濃度的測定。

如圖5所示，當納米tio2的濃度為64mg/l時，硝酸鹽氮可以在16h去除率達100％。在硝酸鹽氮的去除過程中，伴隨了亞硝酸鹽氮的積累，在12h亞硝酸鹽氮的積累量達到最大，具體數值為65.8mg/l。隨著反應的繼續進行，亞硝酸鹽氮逐漸被施氏假單胞菌所降解，24h后亞硝酸鹽被完全去除。以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的綜合代表系統中的總氮，在這一條件下，總氮的去除率可達100％。說明菌株施氏假單胞菌對高濃度納米tio2具有更強的耐受能力。

實施例6

六、施氏假單胞菌在128mg/l納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性

將富集培養后的菌懸液按照10％的接種量接種于含有128mg/l納米tio2的bm培養基中，每隔4h取樣2ml，取樣在8000rpm和4℃條件下離心5min，上清液用于各種含氮化合物濃度的測定。

如圖5所示，當納米tio2的濃度為128mg/l時，硝酸鹽氮可以在10h內被完全去除。在硝酸鹽氮的去除過程中，伴隨了亞硝酸鹽氮的積累，在12h亞硝酸鹽氮的積累量達到最大，具體數值為65.8mg/l。隨著反應的繼續進行，亞硝酸鹽氮逐漸被施氏假單胞菌所降解，20h后亞硝酸鹽被完全去除。以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的綜合代表系統中的總氮，在這一條件下，總氮的去除率可達100％。說明濃度越高，菌株施氏假單胞菌對高濃度納米tio2的耐受能力越強(見表1)。

表1施氏假單胞菌在不同濃度納米二氧化鈦存在條件下的脫氮特性

實施例7

七、施氏假單胞菌在含納米二氧化鈦廢水中的應用

將施氏假單胞菌投加入活性污泥系統處理含納米二氧化鈦廢水，連續曝氣保持體系溶解氧為6mg/l，廢水水質如下：ph為7.5，硝酸鹽氮含量100mg/l，納米二氧化鈦1mg/l。在普通活性污泥系統內，脫氮的效果在納米二氧化鈦存在的條件下受到了較大的影響。然而，經施氏假單胞菌強化后的系統，24h的硝酸鹽氮去除率可達79.3％，總氮去除率可達61.7％；36h的硝酸鹽氮去除率為96.4％，總氮去除率為90.1％(見表2)。

表2施氏假單胞菌pcn-1應用于活性污泥體系中的生物脫氮結果

應當說明的是，以上實施例只是為了對本發明作進一步詳細的描述，不是用來對本發明進行限定的，在不脫離本發明的構思和精神的范圍內，本領域普通技術人員，可以進行各種改進或變化，仍然屬于本發明所附的權利要求的保護范圍。