一種植物乳桿菌來源的苯丙酮酸還原酶及應用的制作方法

本發明涉及一種植物乳桿菌來源的苯丙酮酸還原酶及應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

苯乳酸(phenyllacticacid，pla)，又名2-羥基-3苯基丙酸，是一類非常重要的化合物，在醫藥及生物防腐劑等方面具有非常廣泛的應用。苯乳酸具有與其衍生物丹參素(β-3，4一二羥基苯基乳酸鈉)相同的藥理功能，可以調節人體內的類固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成許多藥物的重要中間物，比如：降血糖藥恩格列酮(englitazone)、非蛋白氨基酸施德丁(statine)、抗艾滋病毒制劑、新型驅腸蟲藥pfl022a等。此外，近年來發現苯乳酸可作為新型的生物防腐劑，且具有非常廣泛的抗菌譜，對革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌、單核增生性李斯特菌)、革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、沙門氏菌)和真核微生物(如曲霉青霉)等均有抑制作用。而苯乳酸生物制備法因其具有高效性、高對映選擇性、高區域選擇性、反應條件溫和、適用范圍廣及環境友好等眾多的優點備受研究者關注。因此，苯乳酸及其催化合成的酶類成為近年來研究的熱點。

1988年，lavermicocca等從酸面團中分離得到的l.plantarum21b,產生的d-苯乳酸量為56mg/l,這是首次關于乳酸菌產生苯乳酸的報道。隨后研究人員陸續發現不同種屬的乳酸菌能夠產生苯乳酸，如李興峰等從泡菜中篩選出112株菌，其中有10株菌產生d-苯乳酸的量超過66.4mg/l。但是由于原始菌株的局限性，其產生苯乳酸的量一般都不高，且不同菌株之間有較大差異，難以達到工業產業化要求。

現有技術中，有研究者發現苯丙酮酸還原酶在催化苯丙酮酸反應12h后，苯丙酮酸的轉化率為91.3％。也有研究者應用lactobacillusplantarumcect-221生產苯乳酸，在優化后的培養條件下，2l的發酵罐中發酵培養158h，苯乳酸產量僅為0.7g/l。由此可以看出，采用發酵法制備苯乳酸的產率較低，產物提取困難，而生物轉化法制備苯乳酸的底物上載量和產率均有所提高，但是反應時間過長，仍不能達到工業化生產的要求,需要進一步開發高效還原酮酸的酶類。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提供一種苯丙酮酸還原酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明的第二個目的是提供編碼所述苯丙酮酸還原酶的基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發明的第三個目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達seqidno.1所示苯丙酮酸還原酶基因。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以pet-28a(+)為載體表達所述苯丙酮酸還原酶基因。

在本發明的一種實施方案中，所述的宿主為大腸桿菌e.colibl21(de3)。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌按如下步驟構建：(1)將seqidno.1所示基因片段與與pucm-t連接后轉化宿主e.colijm109，獲得重組質粒命名為pucm-t-lpppr；(2)將pucm-t-lpppr與pet-28a(+)質粒均用ndei和noti進行雙酶切，在t4dna連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pet-28a(+)-lpppr；(3)將pet-28a(+)-lpppr轉化入e.colibl21(de3)宿主。

本發明的第四個目的是提供所述基因的異源表達方法，所述方法是將所述基因工程菌接種至lb培養基中，于37℃、轉速220rpm培養至od600為0.6～0.8，加iptg至終濃度為0.4-0.6mm進行誘導，18～22℃誘導表達7～9h。

在本發明的一種實施方式中，所述方法具體步驟如下：以含有苯丙酮酸還原酶基因的大腸桿菌e.coli/pet-28a-lpppr為生產菌株，發酵條件為：挑取e.coli/lpppr單菌落接種于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培養基中，于37℃、220r/min培養過夜，按2％的接種量接種到100mllb培養基中，培養溫度為37℃、轉速220rpm培養至od600為0.6-0.8，加iptg至終濃度為0.4-0.6mm進行誘導，18-22℃誘導表達7-9h。收集菌體，8000rpm離心5min收集菌體，用100mm，ph7.0的磷酸鹽緩沖液進行洗滌2-3次，制備成100mg/ml的菌懸液。

本發明還提供一種應用所述苯丙酮酸還原酶制備苯乳酸的方法，是將苯丙酮酸還原酶以16～25u/mmol苯丙酮酸的添加量加入至含葡萄糖和苯丙酮酸的反應體系中。

在本發明的一種實施方式中，所述苯丙酮酸和葡萄糖的質量比為1：0.8～1。

在本發明的一種實施方式中，所述苯丙酮酸是以酶液、酶粉或基因工程菌的形式參與反應。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌的酶活為2～5u/mg菌體。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是以所述基因工程菌為催化劑，以25mm苯丙酮酸為底物，并加入20mm葡萄糖和50mg濕菌體，于37℃溫度下反應。

在本發明的一種實施方式中，所述反應在ph7.0～7.5的磷酸鹽緩沖液中進行。

在本發明的一種實施方式中，所述磷酸緩沖液是濃度為0.1mm的na2hpo4-nah2po4,緩沖液。

本發明還提供所述苯丙酮酸還原酶及表達所述苯丙酮酸還原酶的基因工程菌在食品、生物、醫藥領域的應用。

有益效果：本發明提供了一種苯丙酮酸還原酶，能夠顯著提高苯丙酮酸的轉化效率，使其在以葡萄糖和苯丙酮酸底物的反應體系中，經過5h反應后，底物的轉化率達到98.38％，e.e.值為99.9％。

附圖說明

圖1為反應底物及產物的hplc圖譜；

圖2為重組質粒pet-28a(+)-lpppr的構建示意圖；

圖3為轉化反應進行圖；其中，ppa為苯丙酮酸；pla為苯乳酸。

具體實施方式

苯丙酮酸和苯乳酸標品均購自上海sigma公司；流動相均購自美國tedia天地試劑公司，高效液相色譜柱c-18(4.6×250mm,5μm)購自德國bischoff有限公司。采用高效液相色譜儀waterse2695(美國waters公司)對樣品進行分析。流動相為均含有0.05％的三氟乙酸的甲醇(b)和水(a)的混合液，梯度洗脫程序為：0～15min由20％b線性變化至65％b，15～16min由65％b線性變化至100％并保持3min，19～20min由100％b線性變化至20％，流速1ml/min，檢測波長210nm，柱溫30℃。檢測器為紫外檢測器，色譜柱為c18柱。苯丙酮酸及苯乳酸的出峰時間如圖1所示，苯丙酮酸的出峰時間為11.790min，苯乳酸的出峰時間為12.831min。

酶活測定方法：反應在30℃條件下，連續測定3min在340nm吸收值的變化。酶活定義為：在30℃、ph7.0的條件下，每分鐘消耗1μmolnadh所需的酶量為一個酶活單位(1μmol/min＝1u)

實施例1植物乳桿菌苯丙酮酸還原酶基因的獲得及表達質粒的構建

設計特異性引物：

lpppr-f：5’-catatgatgaaaattttaatgtat-3’，含ndei酶切位點。

lpppr-r：5’-gcggccgcttaaaaggcgtgggccgt-3’，含noti酶切位點。

提取植物乳桿菌的基因組dna，以植物乳桿菌基因組dna為模板，lpppr-f和lpppr-r為引物，進行pcr：94℃變性5min，30個循環(94℃30s、50℃30s和72℃60s)，72℃保溫10min。pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳分析、割膠回收目的基因，與pucm-t連接，轉化e.colijm109，經藍白斑篩選、菌液pcr鑒定和dna測序。將測序正確的重組質粒命名為pucm-t-lpppr。將測序正確的pucm-t-lpppr與pet-28a(+)質粒均用ndei和noti進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在t4dna連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pet-28a(+)-lpppr，并對重組質粒進行序列測定；將pet-28a(+)-lpppr轉化入e.colibl21(de3)中。

實施例2重組菌的誘導表達及條件優化

將e.colibl21-lpppr單菌落接種于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培養基中，于37℃、220r/min培養過夜；按2％接種量轉接于100mllb培養基中，37℃培養至od600為0.6～0.8時，對目的蛋白進行的誘導表達。誘導條件為：添加iptg至終濃度0.4-0.6mmol/l，18-22℃誘導7-9h。收集菌體，用磷酸鈉緩沖液(na2hpo4-nah2po4,100mmol/l,ph7.0)洗滌2-3次，加入同樣緩沖液懸浮得到菌濃為100mg/ml的菌懸液。對反應后的笨乳酸濃度進行測定，結果顯示，d-苯乳酸濃度達7.05～7.79mm。

實施例3d-苯乳酸的制備

在1.5mlep管中加入400μl苯丙酮酸(終濃度25mm)，再加入100μl葡萄糖(終濃度為20mm)，加入500μl菌懸液(酶活為19.7u/mg濕菌體)，40℃反應5h。定時取樣至甲醇中進行稀釋，離心后過0.22μm有機濾膜，進hplc進行檢測。反應進程曲線如圖2所示，在反應210min后，苯丙酮酸含量已低于5mm，在反應進行5h后苯丙酮酸的轉化率為98.38％，e.e.>99.9％，d-苯乳酸產量達到4.15g/l。

對照例1

按實施例2的方式對重組菌進行誘導，區別在于調整誘導溫度為16℃，在其余條件相同的條件下，d-苯乳酸濃度僅6.55～6.62mm。

對照例2

按實施例2的方式對重組菌進行誘導，區別在于調整誘導溫度為25℃，在其余條件相同的條件下，d-苯乳酸濃度僅4.35～5.01mm。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的。

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