本發(fā)明涉及一種菜豆環(huán)氧化物水解酶及其異源表達方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
手性環(huán)氧化物及其水解產物鄰二醇可用于合成手性藥物中間體等物質，在醫(yī)藥等領域可發(fā)揮重要作用。兩個不同構型的物質，有時一個可發(fā)揮藥理作用的同時，另一個構型會產生毒害作用，如沙利度胺的(r)-對映體有鎮(zhèn)靜作用，可治療婦女妊娠反應，但(s)-對映體及其代謝產物有嚴重的胚胎毒性和致畸作用。因此用于合成手性藥物中間體的物質最好以光學異構體的形式應用。
手性純環(huán)氧化物及鄰位二醇可通過化學法和生物法獲得，化學法主要可分為不對稱合成法、選擇吸附拆分法、結晶拆分法、化學拆分法、動力學拆分法和色譜分離法，但都對催化的底物類型要求嚴格、并且反應過程中易造成環(huán)境污染，不符合綠色環(huán)保的生產理念；相比于化學法，生物法更加高效專一，并且反應條件溫和、綠色、經濟，因此逐漸受到重視。生物法中，獲得環(huán)氧化物及鄰二醇的生物法主要有直接加氧途徑、間接環(huán)氧化途徑和酶解拆分合成途徑。環(huán)氧化物水解酶(epoxidehydrolase，ehs)和酯酶均可參與到酶解拆分途徑中，但環(huán)氧化物水解酶(epoxidehydrolases,ehs)不像酯酶對催化的底物類型有限制。
ehs來源廣泛，在小鼠、土豆、黑曲霉(aspergillusniger)等動、植物和微生物中均有發(fā)現(xiàn)，因其可通過調節(jié)環(huán)氧化物在生物體內的含量水平而起到調節(jié)新陳代謝、解毒、調節(jié)信號分子等作用，因此長期以來ehs多被用于生理及生化研究。直到從微生物來源中發(fā)現(xiàn)ehs的存在，才使得其在有機合成中的應用逐漸受到重視。理想ehs可通過動力學拆分或歸一性水解的途徑得到手性純環(huán)氧化物或鄰二醇，但是在實際催化過程中，由于ehs的性質并不理想，使得得到的環(huán)氧化物或鄰二醇的光學純度沒有達到應用要求，并且選擇性ehs動力學拆分時往往只關注提高保留的環(huán)氧化物的光學純度，使得水解產物鄰二醇的光學純度因為不理想而無法應用，造成鄰二醇的浪費。因此仍需挖掘新型ehs，以期應用于手性中間體的合成，手性拆分環(huán)氧化物的同時，也得到手性純鄰二醇，從而實現(xiàn)工業(yè)化的生產。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個目的是提供一種菜豆(phaseolusvulgaris)來源的新型環(huán)氧化物水解酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；
(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有環(huán)氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白質。
本發(fā)明的第二個目的是提供編碼所述環(huán)氧化物水解酶的基因。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本發(fā)明的第三個目的是提供表達所述環(huán)氧化物水解酶的基因工程菌。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌是以pet-28a(+)為載體，在大腸桿菌中表達seqidno,1所示的環(huán)氧化物水解酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述大腸桿菌包括e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、e.colitop10或e.colijm109。
本發(fā)明的第四個目的是提供所述環(huán)氧化物水解酶的應用，是將seqidno.2所示的環(huán)氧化物水解酶用于外消旋環(huán)氧苯乙烷(rac-so)的生物轉化。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述環(huán)氧化物水解酶為酶液、酶粉或負載環(huán)氧化物水解酶的細胞。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用是將所述基因工程菌按1～2g濕菌體/6～8mmol底物的添加量添加至含rac-so的緩沖液中，于22～28℃反應4～18h。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用是將所述基因工程菌按1g濕菌體/6mmol底物的添加量添加至含rac-so的緩沖液中，于22～28℃反應4～18h。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述緩沖液為0.05～0.15mol/l，ph7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應過程中還以200～220r/min攪拌。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用是將所述基因工程菌以1g濕菌體/5ml磷酸緩沖液(k2hpo4-kh2po4,0.1m/l,ph7.0)的濃度懸浮后，添加6mmrac-so進行水解，于25℃、220r/min反應。
本發(fā)明還提供所述環(huán)氧化物水解酶在食品、醫(yī)藥、化工領域的應用。
本發(fā)明還要求保護所述基因工程菌在發(fā)酵領域中的應用。
有益效果：(1)本發(fā)明提供了一種具有動力學拆分作用的環(huán)氧化物水解酶pveh4，能夠水解外消旋環(huán)氧苯乙烷生成(s)-環(huán)氧苯乙烷和(r)-苯乙二醇；(2)本發(fā)明提供了應用該酶定向水解拆分外消旋環(huán)氧苯乙烷的方法，使拆分反應反應4h時，轉化率為67.9％，(r)-環(huán)氧苯乙烷的對映體純度和產率分別為99.9％ees和92.4％eep。相比于現(xiàn)有的動力學拆分外消旋環(huán)氧苯乙烷保留得到(r)-環(huán)氧苯乙烷的ehs，pveh4催化得到的水解產物(r)-ped的對映體純度有所提高，避免了水解產物因為eep不高造成的浪費。
附圖說明
圖1為pet28a-pveh4質粒圖譜。
具體實施方式
以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
外消旋環(huán)氧苯乙烷(rac-so)購自上海tci公司；(s)-環(huán)氧苯乙烷((s)-so)、(r)-環(huán)氧苯乙烷((r)-so)、(s)-苯乙二醇((s)-ped))和(r)-苯乙二醇((r)-ped))購自上海安耐吉公司；其他試劑均為國產分析純。氣相色譜儀gc-2010購自日本shimadzu公司，手性氣相色譜柱cyclosil-b(30m×0.25mm×0.25μm)購自美國agilent科技公司。
樣品分析采用氣相色譜儀gc-2010、手性氣相色譜柱和氫火焰離子化檢測器。分析條件為：進樣口和檢測器溫度250℃；初始柱溫100℃，以5℃/min升溫至195℃；載氣為氮氣，流速3.0ml/min，分流比1:50。正己醇、(r)-so、(s)-so、(s)-ped和(r)-ped的保留時間分別為3.177、5.530、5.614、16.048和16.144min。
計算公式：ees＝[(r-s)/(r+s)]×100％；eep＝[(rd-sd)/(rd+sd)]×100％；(r)-so產率＝r/(r0+s0)×100％，(r)-ped產率＝rd/(r0+s0)×100％。其中：r和s表示(r)-和(s)-so濃度，rd和sd表示(r)-和(s)-ped濃度，r0和s0表示(r)-和(s)-so初始濃度。
酶活性定義：每分鐘內消耗1μmol底物或產生1μmol產物的酶量定義為一個酶活單位(u)。
實施例1pveh4的引物設計
根據(jù)pveh4的一級核苷酸序列設計一對特異性引物，用于克隆pveh4。引物序列如下：
pveh4-f:gaattcatggagaacatacttcacagaat(ecorⅰ)
pveh4-r:ctcgagtcagaactgcttaatgaagtcataaatgt(xhoⅰ)
實施例2pveh4的基因克隆
選取籽粒飽滿的菜豆，30℃浸泡8h，孵育20h。取100mg胚芽提取總rna。以菜豆總rna為模板、oligodt-adaptor為引物，逆轉錄合成cdna第一鏈；以該鏈為模板、pveh4-f和m13primerm4為引物，進行第一輪pcr：94℃變性2min，30個循環(huán)(94℃30s、50℃30s和72℃70s)；再以第一輪pcr產物為模板、pveh4-f和pveh4-r為引物，進行第二輪pcr：94℃變性2min，30個循環(huán)(94℃30s、52℃30s和72℃70s)，72℃延伸10min。pcr產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果表明在約1000bp處有一與預期大小相符的目的條帶，將目的條帶割膠回收后與pucm-t連接，轉化e.colijm109，經藍白斑篩選、sacⅰ酶切鑒定正確后，將重組子進行dna測序。測序結果顯示，pveh4的核苷酸序列如seqidno.1所示，其編碼的酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。將該重組質粒命名為pucm-t-pveh4。
實施例3pveh4的異源表達
用ecorⅰ和xhoⅰ同時雙酶切pucm-t-pveh4和pet-28a(+)質粒，經瓊脂糖凝膠電泳分析后，割膠回收得到pveh4和pet-28a(+)片段，用t4dna連接酶連接過夜，獲重組質粒pet28a-pveh4，轉化入e.colibl21(de3)感受態(tài)中，挑取單菌落于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb中培養(yǎng)4h后，進行菌液pcr驗證，將驗證正確的轉化子進行dna測序。結果正確的轉化子命名為e.coli/pet28a-pveh4。
挑取e.coli/pet28a-pveh4及e.coli/pet28a單菌落接種于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃、220r/min培養(yǎng)過夜；取2ml培養(yǎng)液轉接于100ml相同的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600為0.6～0.8時，添加iptg(終濃度0.3mmol/l)，16℃、220r/min誘導10h后離心收集菌體(8000rpm,5min)。用1g/20ml的kpb(ph7.0)懸浮e.coli/pet28a-pveh4菌體后進行sds-page，結果表明pveh4約在36.5kda處有單一條帶，pveh4基因成功在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達。
實施例4pveh4的活力檢測
將離心收集的菌體用1g/5ml的磷酸緩沖液(k2hpo4-kh2po4,0.1m/l,ph7.0)懸浮，于2ml離心管中加入1455μl菌懸液，于25℃保溫5min，加入45μl200mm外消旋環(huán)氧苯乙烷(rac-so)至終濃度為6mm，在25℃、220r/min，定時取樣100μl反應液至1ml乙酸乙酯(含1mmol/l正己醇作內標)中進行萃取，混合后離心(10000rpm，2min)取上層有機相，添加無水硫酸鎂干燥，經0.22μm有機膜過濾后進行氣相色譜檢測。反應4h時轉化率為67.9％，(s)-so消耗完畢，(r)-so的ees和產率分別為99.9％和32.1％(動力學拆分得到的環(huán)氧化物的理論產率為50％)，(r)-ped的eep和產率分別為92.7％和65.4％；反應12h時轉化率為88.4％。
比較同來來源于菜豆的pveh4與pveh1(genebank:kr604729.1)，pveh1催化rac-so水解達到70％時，(r)-so和(r)-ped分別為30.7％ees和42.3％eep；轉化率為99.1％時，eep為33.6％，ees和eep均低于pveh4。
對照例1
從ncbi數(shù)據(jù)庫中搜索得到另一個來自菜豆基因組的序列(xm_007163062.1)，將該基因命名為pveh5，按照實施例1的策略設計引物：
pveh5-f：5’-catatgatggagaaaatagagcacacaagg-3’(含酶切位點ndeⅰ)；
pveh5-r：5’-ctcgagttaaaatttcttgatgaagtcgtatatatgc-3’(含酶切位點xhoⅰ)。
根據(jù)實施例2的策略克隆該基因，將其在e.colibl21(de3)中進行異源表達，得到重組菌e.coli/pveh5。將重組菌按照實施例3的步驟進行異源表達得到pveh5，按照實施例4測定性質，以e.coli/pet28a為對照，發(fā)現(xiàn)pveh5對rac-so并沒有表現(xiàn)出eh催化活性。將e.coli/pveh5菌懸液與6mmrac-so混勻，于25℃、220r/min共同反應12h后進行氣相檢測，結果分析表明rac-so的濃度相比于e.coli/pet28a對照組中的rac-so的濃度沒有減少；除了rac-so自身水解外，ped的濃度相對于對照組沒有增加。
對照例2
按照實施例3，將pveh4連接至pet32a(+)載體上，獲得重組質粒pet32a-pveh4，將重組質粒導入bl21(de3)中，得到重組菌bl21/pet32a-pveh4并進行發(fā)酵，按照實施例4進行活性測定，發(fā)現(xiàn)酶活性相比于bl21/pet28a-pveh4下降了47％，對映選擇性相比于bl21/pet28a-pveh4并沒有提高。
對照例3
按照實施例3，將pet28a-pveh4導入rosetta(de3)宿主中，得到重組菌rosetta/pet28a-pveh4，按照實施例4測定酶活性，發(fā)現(xiàn)rosetta/pet28a-pveh4酶活性和對映選擇性相比于bl21/pet28a-pveh4并沒有提高。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
sequencelisting
<110>江南大學
<120>一種菜豆環(huán)氧化物水解酶及其異源表達方法
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