糖原基陽離子聚合物的制作方法
本申請是申請日為2013年02月21日、申請號為201380007182.9、發明名稱為“糖原基陽離子聚合物”的中國專利申請的分案申請。
本發明涉及糖原基陽離子聚合物、包括所述聚合物和至少一種陰離子化合物的復合物、和所述復合物用于傳遞陰離子化合物的用途。
特別地，糖原基陽離子聚合物用作非病毒的載體，用于核酸的轉染。
現有技術
為了減少有效成分的副作用并使它們的治療效果最佳化，開發了控制釋放系統，其中藥物的形式控制了有效成分的釋放階段，并且系統還能夠將有效成分傳遞并指向特定的藥理學目標。
特別地，傳遞和指向系統必須以以下的方式來與有效成分產生交互作用：獲得的復合物在儲存和給藥期間是穩定的，但將有效成分釋放至正確的藥理學目標。
典型地，在傳遞系統和有效成分之間形成的交互作用是非共價的，例如：靜電的、離子的或范德華交互作用、氫鍵等。
針對低分子量有效成分，和部分針對聚合物和高分子量分子，例如核酸，解決了開發傳遞和指向系統的問題。
特別地，在基因治療領域，通過術語"轉染"表達的是：為了補償缺乏基因，過表達基因、沉默(silencing)基因表達或向所述細胞引入新的功能的目的，核酸序列和/或遺傳構造向靶細胞插入的自發過程。
在遺傳性疾病的治療以及在慢性疾病的治療和防治用策略的開發兩者中，這個過程似乎是有前途的。
然而，當以天然形式體內給藥時，核酸，很像其它的聚陰離子物質，迅速地被陽離子酶(例如核酸酶和蛋白酶)分解，并有節制地被細胞吸收。
迄今已經研究和開發的基因載體包括病毒系統(逆轉錄酶病毒、腺病毒等)和非病毒系統(脂質體、聚合物、肽等)。
眾所周知的是：病毒載體與非病毒系統相比具有更高的轉染效率。然而，在體內使用病毒載體受到很多缺點的限制，例如復制的危險、誘導免疫反應的可能性、只有再分細胞可有效地作為目標的事實、大尺寸基因低的裝載量或dna片段的隨機插入。
在本領域已知的是：使用基于非病毒載體的基因治療，包括許多益處，其中有相對的安全性和低的制備成本。
已經廣泛研究了非病毒的基因載體，例如陽離子聚合物、脂質體和合成載體，作為使用病毒載體的替代。
n,n-二乙基氨基乙基-葡聚糖(deae-葡聚糖)，是要用于有效成分受控釋放的天然聚合物的第一化學衍生物的一種(例如用于向粘膜中的受控釋放，如，例如在wo90/09780中描述的)，并且接著作為轉染試劑(如，例如在ep1738769中描述的)。
deae-葡聚糖是聚陽離子聚合物，通過n,n-二乙基氨基乙基氯化物和葡聚糖反應獲得，葡聚糖是其中葡萄糖單體通過α-1,6鍵鍵合的線性聚合物，具有很少的支鏈，其中葡萄糖單體是通過α-1,4-鍵鍵合的(編號示于下面的式子中)。
由下列結構式表示的deae-葡聚糖，具有兩個包括含氮殘基的取代基，其中氮原子具有彼此不同的物理化學特性：
第一取代基包括叔胺官能(表示為n')，具有約9.5的pka，其在生理學ph下處于離子化形式。第二取代基，被稱為"串聯的(tandem)"，包括季銨基(n+)，其具有永久的正電荷并影響第二叔胺官能團(表示為n”)，其具有約5.7的pka的酸性，然后在生理學ph下，處于非離子化的形式(f.gubensek,journalofmacromolecularscience:parta-chemistry-2(5)1968,1045-1054)。
然而，已知的是：deae-葡聚糖在體內的正電荷，對除了核酸外的陰離子生物學結構有影響，導致毒性現象。
通常，在陽離子聚合物和核酸之間形成復合物且隨后傳遞的機理，可以概述如下。
遺傳物質被陽離子聚合物通過弱相互作用復合，例如靜電相互作用。該復合物的形成，保護核酸免受核酸酶降解，并能夠使核酸傳遞入細胞中，因為在復合物表面存在的正電荷對細胞膜有影響，通過核內體的形成，刺激復合物的細胞內吞作用。
核內體的內部具有約4.5-5的ph，它與細胞質介質的ph(它是約7.3)相比是更酸性的。由存在于核內體薄膜上的atp-依賴的質子泵來維持這個在ph中的差異，它將h+離子從細胞液推入核內體。酸性ph促進溶酶體核酸酶的活性，它是通過在核苷酸亞基之間的磷酸二酯鍵的水解來負責核酸降解的酶。
具有緩沖能力的聚合物，抑制溶酶體核酸酶的活性，且同時改變核內體的摩爾滲透壓濃度。
實際上，當聚合物螯合h+離子時，細胞液需要其它的h+離子，同時有cl-以保持核內體的電中性。然而，對h+和cl-離子的需要，結果導致核內體內部離子濃度的增加，伴隨著核內體相對于細胞液的摩爾滲透壓濃度的后續增加。摩爾滲透壓濃度的增加向細胞液索要水。從而，核內體溶脹直至破裂，將聚合物-核酸復合物釋放進細胞質中。
這個機理，被稱作"質子海綿機理"，關于聚乙烯亞胺(pei)聚合物，特別被j-p.behr描述在"theprotonsponge:atricktoentercellsthevirusesdidnotexploit"(chimia,1997,51,34-36)中，更普遍地被h.eliyahu等描述在"polymersfordnadelivery"(molecules,2005,10,34-64)中。
聚乙烯亞胺(pei)是線性或支鏈陽離子聚合物，特征在于高效地將低聚核苷酸和質粒釋放進細胞中，在體外，如例如由o.boussif等在"aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo:polyethylenimine"(proc.natl.acad.sci.usa,1995,vol.92,7297-7301)中和國際專利申請wo02/100435中描述的。pei被稱作具有高電荷密度的聚合物，它保護核酸免受核酸酶的降解。人們認為：pei的高緩沖能力，保護核酸在細胞攝取(uptake)階段期間在核內體中免受降解，通過誘導核內體的滲透膨脹("質子海綿"機理)，使得載體-核酸復合物能夠被釋放進細胞質中。
已經作為轉染試劑廣泛研究的另外的聚合物，是聚(l-賴氨酸)(pll)，它例如已經描述在國際專利申請wo03/063827中，其特點在于在生理學ph下被離子化的伯胺基，伯胺基對核酸的磷酸根基團(其是帶負電荷的)有影響。然而，pll的毒性和轉染效力與它們的分子量成正比：一方面，隨著聚合物分子量的增加，觀察到增加的轉染效率，另一方面，觀察到增加的細胞毒性。另外，pll的主鏈在生理條件下幾乎不降解，它的積聚從長遠來看可導致有毒的后果。
就大多數陽離子聚合物而論，pll與核酸的復合物也具有物理化學的缺點。例如，制備過程提供少的尺寸控制能力，這可能導致大顆粒的存在，大顆粒具有有限的擴散容量和/或在配制或給藥階段期間沉降的可能性。另外，看起來：pll的酸堿特性使得不可能獲得高的轉染能力，或許是因為有限的將核酸釋放進入細胞質介質的能力。
其它的陽離子聚合物，天然的和合成的兩種，都已經在現有技術中被描述為核酸的轉染試劑。
例如，國際專利申請wo03/078576描述了殼聚糖作為核酸的轉染試劑。
殼聚糖是天然的線性聚合物，由在聚合物中隨機分布的d-葡聚糖和n-乙酰-d-葡聚糖單元組成，通過β-1,4鍵連接并包括具有約6.5pka的胺基。
作為核酸的轉染試劑，針對包括正離子化基團的樹枝狀大分子已經進行了廣泛的研究，例如聚(酰胺胺)(pamam)結構，線性結構的大分子；甲基丙烯酸聚合物(例如甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯，dmaema)、聚(乙烯亞胺)(pei)和這些聚合物的帶有增溶性、功能性或定向性取代基的衍生物，例如含有聚(乙二醇)(peg)的聚合物結構。
例如描述在國際專利申請wo97/25067中的線性聚(酰胺胺)(pamam)，是水溶性聚合物，它允許形成可溶的和/或可分散的復合物。優選地，這些聚合物的陽離子基團的pka值應保持在7和8之間，因為已知的是：更低的pka值會降低核酸裝載的能力。此外，由基于pamam和核酸的樹枝狀大分子通過核內體形成的復合物的釋放，涉及"質子-海綿"效應。具體地說，c.l.waite等在"acetylationofpamamdendrimersforcellulardeliveryofsirna"(bmcbiotechnology,2009,9:38)描述了：伯胺殘基的部分乙酰化，降低pamam基樹枝狀大分子的緩沖能力和sirna的釋放。
為了除了核酸用轉染試劑外的用途，也已經開發了陽離子聚合物。
例如，在pals等(colloidsandsurfacesa:physicochem.eng.aspects289,2006,pages193-199)文章的2.2段，公開了糖原如何被陽離子化，通過在多糖糖原的主鏈上引入陽離子單體n-(3-氯-2-羥基丙基)-三甲基氯化銨。發現所述陽離子聚合物作為鐵礦懸浮液中的絮凝劑是有效的。
已知的是：理想的轉染試劑應確保高的轉染容量，沒有它就必須要操縱生理學的目標；它在有效劑量下不應是有毒的，并且應是可生物降解的，使得可避免任何長期的副作用。
另外，轉染試劑應該是聚合物，它應該形成小于1微米(即，小于10-6m)的顆粒，優選形成納米顆粒，因為已知的是：尺寸可以限制復合物在細胞外介質中的擴散能力和在細胞中的細胞內吞作用/吞噬作用兩者。
最后，聚合物的結構應包括特征在于不同pka值的胺基和/或氮原子。事實上，具有比生理學ph值更高pka的胺基，促進核酸在生理學ph下的復合；具有大約核內體ph值的pka值的胺基，使"質子-海綿"機理活化，并確保聚合物-核酸復合物向細胞質中的釋放；最后，季銨基確保與ph值無關的、從核內體的復合和釋放。
技術實現要素：
申請人已經解決了如下問題：開發可以用于傳遞低分子量有效成分并作為核酸非病毒載體兩者的新聚合物，并且它可以克服現有技術中已知材料的缺點。
令人驚訝的是，申請人現在已經發現：糖原可以被改性，以獲得新陽離子衍生物。
有利的是，所述糖原的新陽離子衍生物的特征在于低的細胞毒性。
申請人相信這主要是由于兩個原因。第一，糖原是生物相容的聚合物，它是糖在所有動物體內新陳代謝和儲存的產物，在那里它被連續地制造并降解。另外，申請人相信：在糖原中許多的支鏈，賦予穩定的球形結構，它能夠選擇性減少對陽離子電荷的接觸：可溶解的分子可以擴散到聚合物結構內部，并通過陽離子位點進行復合，然而相反，由于空間的原因，與更復雜結構的相互作用將不會被允許。這個球形結構將使得減少陽離子電荷的毒性成為可能，該毒性一般損害細胞膜。
申請人已經發現：該糖原的新陽離子衍生物，保持了它們衍生自的天然聚合物的生物相容性特性。
申請人還發現了：這些糖原的新陽離子衍生物能夠與具有寬范圍內的尺寸和分子量的陰離子化合物形成復合物。
有利的是，所述復合物具有納米尺寸，并且當它們處于溶液中時不表現任何的聚集，即使在高濃度下也如此。
申請人已經發現：該糖原的新陽離子衍生物可以將陰離子化合物傳遞給特定的生理學目標(例如：器官、組織和細胞)。
申請人還已經發現：根據本發明的糖原的陽離子衍生物，能夠滲透進入細胞中。
從而，所述糖原的新陽離子衍生物可用于將陰離子化合物傳遞進細胞中。
最后，申請人已經發現：根據本發明的糖原的陽離子衍生物可以用作蛋白質和酶保存中的穩定劑，和用作疫苗制造中的輔助劑。
有利的是，該糖原的新陽離子衍生物包括攜帶(bearing)胺基的取代基，其特征在于pka值彼此不同，使得促進陰離子化合物的復合和聚合物-陰離子化合物復合物從核內體向細胞質的釋放兩者。
有利的是，根據本發明的糖原的新陽離子衍生物具有低的粘度，從而可以被配置在注射使用的藥物組合物中。
在第一方面，本發明因而涉及基于改性糖原的新陽離子聚合物，本發明特別涉及基于糖原的陽離子聚合物，其包括至少一個選自如下組成的組的重復單元：
(a)
其中
基團r可以是相同或不同的，是氫原子；羧甲基，任選以與藥學上可接受的有機或無機堿形成的鹽的形式；或選自以下的含氮基團：nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-{[(c1-c6)烷基]-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基銨基]-(c1-c6)烷基、含氮環基-(c1-c6)烷基，其中鏈(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任選地用一個或多個羥基取代；和
n是大于或等于1的整數；和
(b)
其中
r1選自：氫原子；羧甲基，任選以與藥學上可接受的有機或無機堿形成的鹽的形式；或選自以下的含氮基團：nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-{[(c1-c6)烷基]-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基銨基]-(c1-c6)烷基，其中鏈(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任選地用一個或多個羥基取代；
x1和x2可以是相同或不同的，是基團-oh或含有氮的基團-nhr2，其中r2選自：氫原子、(c1-c6)烷基和h-[nh-(c1-c6)烷基]p-，其中p是大于或等于1的整數，且基團(c1-c6)烷基可以相同或不同；和
m是大于或等于1的整數；
條件是：r、r1、x1和x2中至少一個是如分別對各個r、r1、x1和x2限定的含氮基團，且
條件是：所述糖原基陽離子聚合物不同于由糖原與n-(3-氯-2-羥基丙基)-三甲基氯化銨反應而獲得的產物。
上述的表述"條件是r、r1、x1和x2中至少一個是如分別對各個r、r1、x1和x2限定的含氮基團"意指：在r是含氮基團的情況下，這個基團如在r中所定義的；在r1是含氮基團的情況下，這個基團如在r1中所定義的；在x1是含氮基團的情況下，這個基團是如在x1中所定義的；并且，在x2是含氮基團的情況下，這個基團如在x2中所定義的。
在第二方面，本發明涉及在糖原基陽離子聚合物和陰離子化合物之間形成的復合物。
根據優選實施方案，所述陰離子化合物是有效成分。有利的是，所述陰離子化合物是核酸。
在第三方面，本發明涉及藥物組合物，其包括在糖原基陽離子聚合物和陰離子化合物之間形成的復合物以及至少一種藥學上可接受的賦形劑。
在第四方面，本發明涉及在糖原基陽離子聚合物和陰離子化合物之間形成的復合物的用途，用于將所述陰離子化合物傳遞或轉染至特定的藥理學目標中，例如器官、組織或細胞。
根據一個優選實施方案，所述陰離子化合物是有效成分。有利的是，所述陰離子化合物是核酸。
附圖簡要說明
附圖的簡要說明
圖1至8表示按照凝膠電泳獲得的八種瓊脂糖凝膠劑，如在實施例5中描述的。在所有的圖1至8中，接種sirna(*)和dna(*)標記物，以獲得相應的譜帶(bands)，用于比較的目的并核對電泳法的功能(functioning)。
圖1表示瓊脂糖凝膠，在其上接種在根據本發明的聚合物3和在各個濃度(從0.5重量％至8重量％)下的sirna之間獲得的復合物。不含核酸(0％)的聚合物3被用作比較，以核對根據本發明的陽離子聚合物不會妨礙關于sirna的斑點的檢測。
圖2表示瓊脂糖凝膠，在其上接種了：
-在根據本發明的聚合物3和在從10重量％至20重量％的濃度下的sirna之間獲得的復合物；
-不含核酸(0％)的聚合物3，作為比較，以核對根據本發明的陽離子聚合物不會妨礙關于sirna的斑點的檢測；和
-聚合物50(未改性的polglumyttm糖原)，作為比較，以核對未根據本發明改性的糖原不能復合核酸。
圖3表示瓊脂糖凝膠，在其上接種在根據本發明的聚合物3和在各個濃度(從30重量％至800重量％)下的sirna之間獲得的復合物。
圖4表示瓊脂糖凝膠，在其上接種了在根據本發明的聚合物1、2和6與在相對于每個聚合物總重量為5重量％至20重量％的sirna之間獲得的復合物。
圖5表示瓊脂糖凝膠，在其上接種了在根據本發明的聚合物10、14和15與在相對于每種聚合物總重量為5重量％和20重量％的sirna之間獲得的復合物。
圖6表示瓊脂糖凝膠，在其上接種了在根據本發明的聚合物8、12和16與在相對于每種聚合物總重量為5重量％和20重量％的sirna之間獲得的復合物。
圖7表示瓊脂糖凝膠，在其上接種了在根據本發明的聚合物21、24和25與在相對于每種聚合物總重量為5重量％和20重量％的sirna之間獲得的復合物。
圖8表示瓊脂糖凝膠，在其上接種了在根據本發明的聚合物20、23和28與在相對于每種聚合物總重量為5重量％和20重量％的sirna之間獲得的復合物。
圖9表示如在實施例8中描述而獲得的根據本發明的聚合物2、3和4用的滴定曲線。
圖10表示如在實施例8中描述而獲得的聚合物4(根據本發明)和18(比較的)用的滴定曲線。
本發明詳細說明
在本說明書和隨后的權利要求書中，措詞"陽離子聚合物"表示在生理學ph下具有總體正電荷的聚合物。
在本說明書和隨后的權利要求書中，術語"糖原"通常是指其特征在于高支化度的葡萄糖均聚物，其中葡萄糖單體在直鏈中通過α-(1,4)鍵的方式鍵接，而支鏈通過α-(1,6)鍵的方式接枝，通常但不限于：每7-11個葡萄糖單體如下式中所示：
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，措辭"糖原基"用來表示：聚合物包括如上所述的糖原結構，其被部分改性以獲得按照本發明的陽離子聚合物。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，措辭"重復單元"標識在按照本發明的陽離子聚合物中出現至少一次的單體。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，措辭"(c1-c6)烷基"表示含有1至6個碳原子的線性或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、3-戊基、異戊基、新戊基、正己基、仲己基或新己基。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，術語"含氮環基"表示3-至7-元芳族或脂族雜環，含有至少一個n原子，例如氮丙啶、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、吡啶或哌啶。任選地，上述雜環可以包括至少一個選自n、o和s的第二雜原子，例如噻唑、噁嗪或噻嗪。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，術語"復合物"表示：根據本發明的糖原基陽離子聚合物與至少一種陰離子化合物，通過非-共價相互作用(例如靜電的、離子的或范德華交互作用、氫鍵等)的交互作用獲得的產物。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，措詞"有效成分"包括天然的、半合成的或合成的分子，其在給藥后能夠與細胞或活的有機體交互作用，并且有改進所述生物機能的可能。因此，按照本發明有用的有效成分，是帶有整體負電荷的分子，即：陰離子分子，其可以用于病理狀態的治療、預防或診斷。所述陰離子分子可以是有機的或無機的。例如，它們可以是有機陰離子分子，并可以具有低分子量(例如氨基酸、磺酰胺或維生素)或高分子量(例如疫苗或葡糖胺聚糖，例如肝素)。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，術語"核酸"表示天然或合成來源的核苷酸大分子，其是雙鏈或單鏈的，并且其具有整體負電荷。特別地，這個術語包括低聚核苷酸、rna(sirna、dsrna、ssrna、shrna、mirna、rrna、hnrna、mrna、trna、snrna、前信使rna、催化rna、反義rna)、dna(cdna、mtdna、ssdna、dsdna、反義dna、質粒dna)。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，措詞"遞送有效成分"和"傳遞有效成分"表示：將復合至根據本發明的陽離子聚合物的有效成分，傳輸到特定的生理學目標，例如組織或器官。
為了本說明書和隨后的權利要求書的目的，術語"轉染"表示：將核酸序列引入細胞中，特別是引入到細胞質和/或核中。
特別地，本發明涉及糖原基陽離子聚合物，包括至少一種選自如下組成的組的重復單元：
(a)
其中
基團r可以是相同或不同的，是：氫原子；羧甲基，任選以與藥學上可接受的有機或無機堿形成的鹽的形式；或含氮的基團，選自nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基銨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基銨基]-(c1-c6)烷基、含氮環基-(c1-c6)烷基，其中鏈(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任選地用一個或多個羥基取代；和
n是大于或等于1的整數；和
(b)
其中
r1選自：氫原子；羧甲基，任選以與藥學上可接受的有機或無機堿形成的鹽的形式；或含氮的基團，選自nh2-(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基銨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基、[三(c1-c6)烷基銨基]-(c1-c6)烷基，其中鏈(c1-c6)烷基可以是相同或不同的，任選地用一個或多個羥基取代；
x1和x2可以是相同或不同的，是基團-oh或含有氮的基團-nhr2，其中r2選自：氫原子、(c1-c6)烷基和h-[nh-(c1-c6)烷基]p-，其中p是大于或等于1的整數，且基團(c1-c6)烷基可以相同或不同；和
m是大于或等于1的整數；
條件是：r、r1、x1和x2中至少一個是如分別對各個r、r1、x1和x2限定的含氮基團，和
條件是：所述糖原基陽離子聚合物不同于由糖原與n-(3-氯-2-羥基丙基)-三甲基氯化銨反應而獲得的產物，特別是如在pals等的文章(colloidsandsurfacesa:physicochem.eng.aspects289,2006,第193-199頁)的2.2段公開的。
優選地，基團r可以是相同或不同的，是氫原子；羧甲基，任選以與藥學上可接受的有機或無機堿形成的鹽的形式；或選自以下的含氮基團：[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基-二(c1-c3)烷基銨基}-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基氨基}-(c1-c3)烷基或[三(c1-c3)烷基銨基]-(c1-c3)烷基、含氮環基-(c1-c3)烷基，其中鏈(c1-c3)烷基可以是相同或不同的，任選地用一個羥基取代。
優選地，由術語"含氮環基"表示的含有至少一個n原子的雜環是5-或6-元芳族或脂族雜環，例如吡咯、吡咯啉、吡咯烷、吡啶或哌啶。有利的是，所述5-或6-元雜環包括選自n、o和s的至少一種第二雜原子，并且例如由二唑、噁嗪和噻嗪代表。優選地，所述雜環是脂族的。更優選地，所述雜環是嗎啉或哌啶。
更優選地，基團r可以是相同或不同的，是氫原子；羧甲基，任選以與藥學上可接受的有機或無機堿形成的鹽的形式；或選自以下的含氮基團：n,n-二甲基氨基乙基、n,n-二甲基氨基丙基、n,n-二乙基氨基乙基、[(n,n-二甲基氨基-乙基)二甲基銨基]乙基、[(n,n-二甲基氨基丙基)二甲基銨基]丙基、[(n,n-二乙基氨基-乙基)二乙基銨基]-乙基、[三甲基銨基]-2-羥基丙基、哌啶基-n-乙基或嗎啉基-n-乙基。
優選地，r1是氫原子；羧甲基，任選以與藥學上可接受的有機或無機堿形成的鹽的形式；或選自以下的含氮基團：[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基-二(c1-c3)烷基銨基}-(c1-c3)烷基、{[n,n-二(c1-c3)烷基氨基]-(c1-c3)烷基氨基}-(c1-c3)烷基或[三(c1-c3)烷基銨基]-(c1-c3)烷基，其中鏈(c1-c3)烷基可以是相同或不同的，任選地用一個羥基取代。
更優選地，r1是氫原子或羧甲基。
優選地，x1和x2可以是相同或不同的，是-nhr2基，其中r2是氫原子或h-[nh-(c1-c4)烷基]p-，其中p是大于或等于1的整數，且基團(c1-c4)烷基可以是相同或不同的。
優選地，所述基團h-[nh-(c1-c4)烷基]p-是：聚乙烯亞胺，具有50至3000道爾頓的分子量，更優選具有1000至2300道爾頓的分子量；精胺(h2n(ch2)3nh(ch2)4nh(ch2)3nh2)或亞精胺(h2n(ch2)4nh(ch2)4nh2)。
藥學上可接受的有機堿的例子是氨丁三醇、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、丙胺、二丙胺、三丙胺、乙二胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胍、嗎啉、哌啶、吡咯烷、哌嗪、1-丁基哌啶、1-乙基-2-甲基哌啶、n-甲基哌嗪、1,4-二甲基哌嗪、n-芐基苯乙胺、n-甲基葡糖胺和三(羥甲基)氨基甲烷。
藥學上可接受的無機堿的例子是堿金屬或堿土金屬氫氧化物或碳酸鹽，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸鈣。
有利的是，所述重復單元(a)和(b)在糖原鏈中隨機分布。
重復單元(a)和(b)的例子分別列在下表a和b中。
表a–重復單元(a)的例子
表b–重復單元(b)的例子
根據優選實施方案，所述重復單元(a)和(b)包括：至少一個含有氮的基團，其是在生理學ph下是可離子化的，并且它促進所述陰離子化合物的復合；和至少一個含氮的基團，其是在低于生理學ph的ph下是可離子化的，并且它促進復合物從核內體的釋放。
優選地，所述在生理學ph下可離子化的含氮基團以1％至30％的數值百分比存在，所述數值百分比是相對于在用于制備根據本發明的陽離子聚合物的糖原中的羥基總數的數值百分比。
優選地，所述在低于生理學ph的ph下可離子化的含氮基團以0.1％至10％的數值百分比存在，所述數值百分比是相對于在用于制備根據本發明的陽離子聚合物的糖原中的羥基總數的數值百分比。
為了本發明的目的，所述在生理學ph下可離子化的含氮基團，是nh2(c1-c6)烷基、[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、nh2-[(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基、{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c6)烷基氨基}-(c1-c6)烷基和含氮環基-(c1-c6)烷基。
為了本發明的目的，所述在低于生理學ph的ph下可離子化的基團，是nh2-{[(c1-c3)烷基]-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基和{[n,n-二(c1-c6)烷基氨基]-(c1-c3)烷基-二(c1-c6)烷基銨基}-(c1-c6)烷基。
有利的是，根據本發明的糖原的新陽離子衍生物具有低的粘度，并且從而可以被配置在注射使用的藥物組合物中。特別地，根據本發明的糖原的新陽離子衍生物，具有小于10mpa*s的粘度，優選小于5mpa*s，所述粘度是在pbs中1％的濃度下用轉動流變儀測量的。
用于制備根據本發明的陽離子聚合物的糖原，可以按照本領域已知方法的一種來獲得。
優選地，如在國際專利申請wo94/03502中描述的來制備糖原。
優選地，所述糖原是從貽貝(mytilusedulis)和紫貽貝(mytilusgalloprovincialis)物種獲得的。
可以用于本發明目的的糖原的其它來源，包括：有殼的水生動物，例如蠔和履螺屬(crepidula)fornicata；和脊椎動物的富糖原器官，例如肝臟和肌肉。
優選地，所述糖原基本上不含含有氮的化合物和還原糖。如在本說明書和隨后的權利要求書中使用的，表述"基本上不含含有氮的化合物和還原糖"表示：氮含量小于60ppm，如通過kieldahl方法測量的；并且還原糖的含量小于0.25％，通過f.d.snell和snell("colorimetricmethodsofanalysis",newyork,1954,vol.iii,p.204)方法測量的。
優選地，根據本發明使用的糖原的特征還在于：碳含量從約44％至約45％，分子量約(2.5±0.1)×106道爾頓，且旋光度(α)d20是197±2.0(c＝1，在水中)。
更優選地，根據本發明使用的糖原是polglumyttm糖原，由aziendechimicheriuniteangelinifrancescoa.c.r.a.f.s.p.a制得。
本領域技術人員將容易理解：本發明本質上不致力于新種類的具有治療效果的化合物。相反地，本發明涉及如前述的糖原基陽離子聚合物用于形成與至少一種陰離子化合物的復合物的用途。
在第二方面，本發明涉及在糖原基陽離子聚合物和陰離子化合物之間形成的復合物，其中所述糖原基陽離子聚合物包括至少一個選自由之前描述的(a)和(b)組成的組的重復單元。
優選地，所述的陰離子化合物是有機的或無機的，具有低分子量或高分子量。
更優選地，所述陰離子化合物是屬于例如下列分類的有效成分：抗感染劑，例如抗生素和抗病毒劑；鎮痛藥；食欲抑制劑；抗蠕蟲藥；止喘藥；抗驚厥藥；抗抑郁藥；抗糖尿病藥；止瀉劑；抗組胺劑；消炎藥；抗偏頭痛劑；抗惡心劑；抗腫瘤藥；抗帕金森氏病藥；抗癢疹劑；抗精神病藥；解熱藥；鎮痙藥；抗膽堿能藥；擬交感神經藥；黃嘌呤衍生物；心血管系統用的藥物，例如鉀、鈣通道阻滯劑、β阻滯劑、α阻滯劑和抗心律失常藥；抗高血壓藥；利尿劑和制尿藥；中央和周圍血管擴張藥；中樞神經系統興奮劑；血管收縮劑；止咳藥；減充血劑；激素；催眠藥和鎮靜藥；免疫抑制劑；肌肉松弛藥；解副交感神經劑；精神興奮劑；鎮靜劑；鎮定劑。
根據優選實施方案，所述陰離子化合物是核酸。
優選地，所述核酸選自：低聚核苷酸、rna(sirna、dsrna、ssrna、shrna、mirna、rrna、hnrna、mrna、trna、snrna、前信使rna、催化rna、反義rna)和dna(cdna、mtdna、ssdna、dsdna、反義dna、質粒dna)。
本申請人注意到：所述復合物能夠形成具有1和200nm之間、優選在20至100nm之間、并更優選30和50nm之間的平均直徑(z)的納米顆粒。
根據優選方案，所述復合物包括含量相對于所述糖原基陽離子聚合物重量在5重量％至60重量％之間的所述陰離子化合物。
優選地，所述復合物包括含量相對于所述糖原基陽離子聚合物重量在10重量％和50重量％之間的所述陰離子化合物。
更優選地，所述復合物包括含量相對于所述糖原基陽離子聚合物的重量在10重量％和30重量％之間的所述陰離子化合物。
在糖原基陽離子聚合物和陰離子化合物之間形成的復合物可有利地被制備為藥物組合物。
在第三方面，本發明涉及包括在糖原基陽離子聚合物和陰離子化合物之間形成的復合物以及至少一種藥學上可接受賦形劑的藥物組合物，其中所述糖原基陽離子聚合物包括至少一個選自由之前描述的(a)和(b)組成的組的重復單元。
在一個優選實施方案中，所述陰離子化合物是核酸。
術語"賦形劑"意指本領域已知的適合于制備藥物形式的任何試劑。
根據本發明適宜的賦形劑的例子是：防腐劑、穩定劑、表面活性劑、滲透壓力調節鹽、乳化劑、甜味劑、矯味劑、染料等等。
所述藥物組合物可以根據本領域已知的方法制備在單位劑型中。
優選地，所述的藥物組合物用于注射使用，例如水溶液、懸浮液或乳液，或者可以是要被重構用于制備靜脈內、肌內、皮下、透皮或腹膜內給藥用的水溶液、懸浮液或乳液的粉末形式。
或者，所述藥物組合物例如可以是如下形式：口服用的片劑、膠囊、糖衣片劑、顆粒、溶液和糖漿；透皮給藥用的加藥硬膏劑、溶液、糊劑、乳膏劑或潤發油；直腸給藥用的栓劑；氣溶膠給藥用的無菌溶液；用于立即和持續釋放的形式。
在第四方面，本發明涉及在糖原基陽離子聚合物和陰離子化合物之間形成的復合物的用途，用于將所述陰離子化合物傳遞或轉輸到特定的藥理學目標，例如器官、組織或細胞，其中所述糖原基陽離子聚合物包括至少一個選自由之前描述的(a)和(b)組成的組的重復單元。
根據優選實施方案，所述陰離子化合物是有效成分。有利的是，所述陰離子化合物是核酸。有利的是，所述藥理學目標是細胞。
在優選實施方案中，按照本發明的糖原基陽離子聚合物可以直接或通過間隔基被共軛到定向基團，它能夠以高度特異的方式結合細胞表面上的目標，并且能夠促進復合物被吸收進特定細胞(例如腫瘤細胞、肝細胞、造血細胞等)中。
定向基團也可以用于將陽離子聚合物定向到細胞小室(例如細胞核、線粒體等)。
定向基團例如可以選自葉酸、單糖、低聚糖、肽、蛋白質和透明質酸低聚物。
隨后的實施例用于說明本發明，然而不以任何方式限定它。
實施例
實施例1
制備包括單元(a)的糖原基陽離子聚合物
(i)合成包括含氮基團的糖原基陽離子聚合物
在裝備有磁力攪拌器和回流冷凝器的兩頸圓底燒瓶中，將10gpolglumyttm糖原(61.73mmol的葡萄糖)溶解在124ml1n的naoh(合成產物1-7、9-11和13-15用的)或2n的naoh(合成產物8、12和16用的)。一旦溶解完全，將混合物加熱到70℃，并攪拌2小時。
取決于需要的產物，以在表1中列的量(表示為mmol試劑)添加下列試劑(i)至(vi)的一種：
(i)2-氯-n,n-二乙基乙胺鹽酸鹽，；
(ii)3-氯-n,n-二甲基丙胺鹽酸鹽；
(iii)2-氯-n,n-二甲基乙胺鹽酸鹽；
(iv)3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨在水中60重量％的溶液；
(v)1-(2-氯乙基)哌啶；和
(vi)4-(2-氯乙基)嗎啉。
將混合物在70℃下攪拌整夜。
次日，停止加熱，并將混合物冷卻至室溫。然后將粗反應產物慢慢倒入400ml丙酮中。一旦完成添加，將獲得的懸浮液攪拌約30分鐘。在停止攪拌后，將混合物放置來沉積，直至上層清液分離，并獲得沉淀物。
丟棄上層清液，并將獲得的沉淀物用丙酮(200ml)洗滌兩次。將由此獲得的固體濾出，溶解在200ml蒸餾水中，用1n的hcl溶液調節到中性ph，最后在再生纖維素管(截止(cut-off)15000)中反蒸餾水進行透析，直至電導率為常數(等于約2-3μs)。將獲得的溶液通過0.45μm過濾器過濾，在真空下濃縮，并最后凍干。
合成產率列于下表1中。
通過所述的方法，制備具有下述表2中所示結構的陽離子聚合物1-16和40-41。
在所示的結構中，縮略語"glu"表示：可以采用未改性葡萄糖的重復單元或者與按照本發明的重復單元延續的聚合物鏈。另外，為了便于可視化，未表示支鏈，并且只在位置6和不同重復單元上表示取代基。
本領域技術人員將容易理解：相同的重復單元可以包括1至3個取代基，其可以是相同或不同的，并且這些取代基可以獨立地存在于位置2、3和/或6。
(ii)合成包括含氮基團和羧甲基的糖原基陽離子聚合物
如下所述地合成含有至少一個羧甲基的polglumyttm糖原(glycogen-cm)。
將預先在60℃烘箱中真空下干燥至恒重的無水polglumyttm糖原的9.57g(59.07mmol的葡萄糖)，放進裝備有磁力攪拌器并處于氮氣流下的兩頸圓底燒瓶中，并溶解在200ml無水二甲基亞砜中。一旦溶解完成，以表3中所列的量加入氫化鈉，并將混合物在室溫下攪拌1小時。然后，以表3中所列的量加入氯乙酸鈉，并將混合物在室溫下攪拌整夜。
次日，將混合物慢慢倒入丙酮(800ml)中，并將獲得的懸浮液攪拌約30分鐘。將獲得的固體濾出，用丙酮(400ml)沖洗兩次，再次濾出，并溶解在蒸餾水(200ml)中。將獲得的溶液在再生纖維素管(截止(cut-off)15000)中反蒸餾水進行透析，直至電導率為常數(等于約2-3μs)。將獲得的溶液通過0.45μm過濾器過濾，在真空下濃縮，并最后凍干。
衍生化程度(dd)，被理解為是每100個葡萄糖單體中采用羧甲基衍生化的葡萄糖分子的數量，通過用含有已知滴定度的polglumyttm糖原和醋酸鈉的混合物產生標準曲線，通過ir光譜確定。
表3
由此獲得的糖原-cm被用于下列合成中，以獲得包括氮基團的陽離子聚合物。
特別地，合成包括二乙基氨基乙基的糖原-cm(deae-糖原-cm)和2-羥基丙基三甲基銨的糖原-cm(2-oh-ptma-糖原-cm)。
deae-糖原-cm
在裝備有磁力攪拌器和回流冷凝器的兩頸圓底燒瓶中，將1g產物103溶解在10.8ml的1nnaoh中，并在70℃下加熱2小時。
添加0.929g2-氯-n,n-二乙基乙基胺鹽酸鹽(5.4mmol)，并將混合物在70℃下攪拌整夜。
次日，停止加熱，并將混合物冷卻至室溫。然后將粗反應產物慢慢倒入100ml丙酮中。在添加的結尾，將獲得的懸浮液攪拌30分鐘。
將由此獲得的固體濾出，用丙酮(100ml)沖洗兩次，溶解在50ml蒸餾水中，用1n的鹽酸調節到6.5-7的ph，最后在再生纖維素管(截止(cut-off)15000)中反蒸餾水進行透析，直至電導率為常數(等于約2-3μs)。將獲得的溶液通過0.45μm過濾器過濾，在真空下濃縮，并最后凍干。
2-oh-ptma-糖原-cm
在裝備有磁力攪拌器和回流冷凝器的兩頸圓底燒瓶中，將2.5g產物103溶解在27ml的1nnaoh中，并在70℃下加熱2小時。
然后，加入3-氯-2-羥基丙基三甲基氯化銨溶液(在水中60重量％，＝8.1mmol)，并將混合物在70℃下攪拌整夜。
次日，停止加熱，并將混合物冷卻至室溫。然后將粗的反應產物慢慢倒入80ml丙酮中。
將獲得的固體濾出，用丙酮(80ml)沖洗兩次，溶解在50ml蒸餾水中，隨后在再生纖維素管(截止(cut-off)15000)中反蒸餾水進行透析，直至電導率為常數(等于約2-3μs)。將獲得的溶液通過0.45μm過濾器過濾，在真空下濃縮，并最后凍干。
通過所述方法獲得的陽離子聚合物17和19示于下表4中。
另外，為了便于可視化，未顯示支鏈，并且只在位置6和不同重復單元上顯示了取代基。在所示的結構中，縮略語"glu"表示：可以采用未改性葡萄糖的重復單元或者采用按照本發明的重復單元延續的聚合物鏈。
本領域技術人員將容易理解：相同的重復單元可以包括1至3個取代基，其可以是相同或不同的，并且這些取代基可以獨立地存在于相同的重復單元的2、3和/或6位。
實施例2
制備包括單元(b)的糖原基陽離子聚合物
按照下面的方法，將polglumyttm糖原用高碘酸鉀氧化。
在暗色玻璃瓶中，將20g的polglumyttm糖原(123.46mmol的葡萄糖)溶于400ml蒸餾水中。以表5中所示的量(用試劑的mmol表示)加入高碘酸鉀，并將混合物在室溫下攪拌30分鐘。
通過加入過量的乙二醇(26ml)，在室溫下持續攪拌2小時，將反應停止。
將獲得的混合物在再生纖維素管(截止(cut-off)15000)中反蒸餾水進行透析，直至電導率為常數(等于約2-3μs)。然后，將混合物通過0.45μm過濾器過濾，并凍干。
然后，通過用0.1n的naoh滴定由鹽酸羥胺和在各個碳水化合物上存在的自由醛基之間的反應釋放的鹽酸，來確定氧化程度(氧化的葡萄糖單體的％)。反應如下：
糖原-(ch＝o)z+z·h2n-oh*hcl＝糖原-(ch＝n-oh)z+z·h2o+z·hcl
通過下式確定氧化單體的百分比：
其中
v＝naoh的ml數
n＝naoh的當量濃度(normality)
w＝無水樣品的mg數
162＝葡萄糖重復單元的分子量
表5
由此獲得的氧化polglumyttm糖原與以下試劑(vii)至(x)之一反應，以在表6中給出的量(表示為試劑的mmol)：
(vii)精胺(fluka，參照號85590)；
(viii)四亞乙基五胺(fluka，參照號15652843)；
(ix)聚乙烯亞胺mw1300在水中50重量％的溶液(aldrich，參照號482595)；
(x)聚乙烯亞胺mw2000在水中50重量％的溶液(aldrich，參照號408700)。
按照以下一般的方法來合成衍生物。
在裝備有機械攪拌器(ikalabortechnik型)的三頸圓底燒瓶中，將2g氧化polglumyttm糖原溶解在ph8.5下的200ml硼酸鹽緩沖液中。將胺溶于40ml硼酸鹽緩沖液中，慢慢加入反應燒瓶，并將混合物在室溫下機械攪拌。
在4小時后，添加硼氫化鈉(473mg；12.5mmol)，并將混合物在室溫下機械攪拌整夜。
次日，將粗反應產物慢慢倒入400ml丙酮中，并將獲得的懸浮液攪拌30分鐘。將獲得的固體濾出，用丙酮(400ml)沖洗兩次，再次濾出，并溶解在蒸餾水(100ml)中。將溶液用1nhcl中和，并在再生纖維素管(截止(cut-off)15000)中反蒸餾水進行透析，直至電導率為常數(等于約2-3μs)。將獲得的溶液獲得通過0.45μm過濾器過濾，并最終凍干。
表6
通過所述方法獲得的陽離子聚合物20-30示于下表7中。在所示的結構中，縮略語"glu"表示：可以使用未改性葡萄糖的重復單元或者使用按照本發明的重復單元延續的聚合物鏈。為了便于可視化，未顯示支鏈，并且在不同的重復單元上顯示取代基。
實施例3
確定含有(a)類重復單元的陽離子聚合物的衍生度(衍生程度)(dd)
相對于在含有重復單元(a)的聚合物中存在的含氮基團數量的衍生度，是通過將胺基轉化成相應的鹽酸鹽并確定在胺基或季銨基上存在的鹵素離子數來計算的。
將相同的過程應用于deae-葡聚糖鹽酸鹽(商業產品deae-葡聚糖鹽酸鹽，sigma，參照號d9885)，用作比較產品。
基于聚合物干重確定鹵素離子數量，干重是通過減去由karlfischer方法確定的含水量獲得的。
將1g胺衍生物溶于10ml蒸餾水中。一旦溶解完成，加入10ml1n的鹽酸，并將混合物攪拌30分鐘。一旦攪拌完成，將混合物注入丙酮中(100ml)。將獲得的固體濾出，用丙酮(100ml)沖洗兩次，并在60℃下烘箱中真空干燥。
鹵素離子的量表示為重量百分數，即：如同每100g陽離子聚合物的鹵素離子重量。
為了確定的目的，每個氮原子被認為是獨立取代的。
按照如下給出的等式，計算衍生度。
dd＝衍生度
h.i.＝每100g含水樣品的鹵素離子克數
mw＝用單個烷基胺鹽酸鹽基取代的單體的分子量
35.45＝氯的分子量
獲得的結果示于下表8中。
表8
(*)比較的：deae-葡聚糖
研究了衍生度和官能團的影響，作為兩個操作參數的函數：(i)聚集的傾向，其必須被最小化；和(ii)裝載容量，其必須被最大化。
實施例4
動態光散射(dls)測量
動態光散射研究用來研究陽離子聚合物的聚集傾向。
針對如在實施例1中描述而制備的基于polglumyttm糖原的陽離子聚合物，并針對以各個sirna/聚合物重量百分比制備的各自與sirna(invitrogen，供應商參照號1299001)形成的復合物，如下面報告的進行動態光散射研究。
對于光散射研究，制備下列溶液：
-溶液1：sirna在無rnase的pbs中0.1mg/ml的貯備液；
-溶液2：各種陽離子聚合物在無rnase的pbs中在0.2mg/ml濃度下的貯備液，通過0.22μm無菌過濾器過濾；
-溶液3：無rnase的pbs溶液，過濾通過0.22μm無菌過濾器。
縮略語pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)表示：在7.4ph下的標準磷酸鹽緩沖鹽水，包括8g/l氯化鈉、1.78g/l磷酸鈉、0.2g/l氯化鉀和0.27g/l磷酸鉀的水性鹽溶液。
通過將溶液1、2和3按照表9中給出的比例混合，獲得分析的樣品。然后將樣品通過攪拌處理30秒，并靜置30分鐘，進行兩次。在通過攪拌30秒并靜置1小時的隨后處理之后，用dlszetasizernanomalvern分析樣品，在分析之前通過攪拌5分鐘來小心處理該溶液。
在25℃下在173°散射角下，利用氦氖激光器(λ＝632.8nm)進行測量。利用zetasizer軟件處理結果。
表9
該研究使得確定下列參數成為可能：
1.不含sirna的polglumyttm糖原的陽離子衍生物的平均直徑(z)(結果列示于表10中)；
2.納米顆粒的長徑比(結果列在表10中)；和
3.相對于沒有觀察到聚集現象的聚合物的重量，sirna的最大重量百分比(結果列在表10中)。
表10
(*)比較的：deae-葡聚糖
(1)平均直徑(z)
如可以從表10看出的，所有衍生物具有小于100nm的平均直徑(z)。
有利的并且與deae-葡聚糖形成對比的是，按照本發明的陽離子衍生物形成具有小于70nm平均粒徑(z)的納米顆粒。
(2)長徑比
長徑比是在由平均直徑標準化的顆粒尺寸分布峰中間高度的寬度，且因此描述尺寸分布峰的形狀。
如可以看出的，所有按照本發明的陽離子聚合物具有長徑比在0.8和1.1之間的粒徑分布，與deae-葡聚糖不同，deae-葡聚糖具有長徑比等于4.5的粒徑分布。
這表明了：通過使用相同的合成方法，按照本發明的糖原基陽離子聚合物使得獲得在接近于平均值的粒度范圍內的受控尺寸的納米顆粒成為可能。
(3)對于沒有觀察到聚集的那些的sirna/聚合物的最大重量百分比
結果顯示：根據本發明的包括所有取代基的陽離子聚合物，形成高達50重量％sirna的無聚集體的復合物，與衍生度有關。
聚合物18(deae-葡聚糖)只形成達到20重量％sirna的無聚集體的復合物。
實施例5
確定裝載容量
通過凝膠電泳來確定一系列含有重復單元(a)和(b)的衍生物的裝載容量。
按照下列方法來制備復合物。
使用各個sirna/聚合物比例(重量％)，來制備sirna和各個聚合物衍生物之間的復合物。
如在表11和12中描述的各個濃度下的聚合物溶液，與不含核糖核酸酶(rnase)的pbs混合，采用在不含rnase的水中0.340mg/ml的sirna溶液(invitrogen，參照號1299001)，過濾通過0.2μm過濾器。然后，通過攪拌約30秒來處理混合物，在室溫下靜置15分鐘，再次攪拌處理30秒，并且在靜置約30分鐘后，進行凝膠電泳。
通過將10μl各個復合物的溶液裝載在(在mops-edta-醋酸鈉緩沖液中制備的)含有1:200000比例greengelplustmnucleicacidstain20000x的4％瓊脂糖凝膠上，來顯影(developed)凝膠。
在80v的恒壓下，來顯影1小時的瓊脂糖凝膠。通過imagequantlas4000系統(gehealthcare)的方式，來獲得圖像。
獲得的凝膠示于圖1至8中。
利用聚合物溶液和sirna，以在下表11中給出的量，來制備在聚合物3(deae-糖原)和sirna之間形成的復合物。將聚合物3裝載0.5重量％至800重量％的sirna。
在其上接種聚合物3和sirna之間形成的復合物，且隨后通過電泳來顯影的凝膠，示于在表11中所列的圖中。
表11
將未改性的polglumyttm糖原(50*)用作比較：
在圖1中，可以看出：在與sirna以0.5重量％至8重量％百分比復合的聚合物3的欄中，不存在單獨相當于sirna的白色譜帶。該譜帶的不存在表明：聚合物3能夠與相對于聚合物重量為0.5重量％至8重量％的sirna完全復合。
在圖2中，在與sirna復合的聚合物3的欄中，相當于sirna的譜帶的不存在表明：聚合物3能夠與相對于聚合物重量為10重量％至20重量％百分比的sirna完全復合。在聚合物50(未改性的polglumyttm糖原)的欄中，相當于sirna的譜帶的存在表明：未改性的polglumyttm糖原不能與sirna復合，即使在相對于聚合物的重量等于10重量％的百分比下也如此。
在圖3中，在與30％的sirna復合的聚合物3的欄中，相當于sirna的譜帶的不存在表明：聚合物3能夠與相對于聚合物總重量為30重量％的sirna完全復合。相反，相當于在50重量％至800重量％的百分比的sirna譜帶的存在，表明：聚合物3不能與相對于聚合物總重量為50重量％的sirna復合。
因此，這些研究表明：聚合物3的最大裝載容量是30重量％的sirna。相反，未改性的polglumyttm糖原(聚合物50)不能復合sirna。
另外，利用下列聚合物來制備聚合物-sirna復合物：
-第1、2、6、8、10、12、14、16號，包括重復單元(a)；
-第20、21、23、24、25、28號，包括重復單元(b)；
使用兩個sirna裝載百分比：相對于聚合物的重量為5％和20％。使用的溶液列于下表12中。
表12
在圖4中，在分別與5重量％和20重量％的sirna復合的聚合物1的欄中，相當于sirna的譜帶的存在表明：聚合物1(具有低衍生度的deae-polgumyt)不能復合sirna。聚合物2能夠與相對于聚合物總重為5重量％的sirna復合，并且聚合物6也能夠與相對于聚合物總重為20重量％的sirna復合。
在圖5中，在與20重量％的sirna復合的聚合物10和14的欄中，相當于sirna的譜帶的存在表明：這些聚合物能夠與5重量％的sirna復合。相反，聚合物15能夠復合20重量％的sirna。
在圖6中，相對于sirna的譜帶的不存在表明：聚合物8、12和16能夠復合20重量％的sirna。
在圖7中，在聚合物24和25的欄中，相當于sirna的譜帶的存在表明：這些聚合物不能復合5％的sirna。相反，聚合物21也復合了20％的sirna。
在圖8中，在與20％的sirna復合的聚合物23和20的欄中，相當于sirna的譜帶的存在表明：這些聚合物復合了5％的sirna。相反，聚合物28復合了20％的sirna。
因此，通常，該研究使得可能表明：僅僅聚合物1(具有最低衍生度的deae-糖原)、24和25夠復合小于5重量％的sirna。
所有其他衍生物能夠復合20％的sirna，像比較的聚合物18(deae-葡聚糖)。相反，聚合物50(未改性的polglumyttm糖原)不能與sirna形成復合物。
實施例6
polglumyttm糖原的陽離子衍生物的細胞毒性研究
針對(deae)-糖原(聚合物1-4)、(dmap)-糖原(聚合物5-8)、(dmae)-糖原(聚合物9-12)、(2-oh-ptma)-糖原(聚合物13-16)、針對未改性的polglumyttm糖原(聚合物50)、針對deae-葡聚糖鹽酸鹽(聚合物18)和針對其它已經被廣泛研究了核酸運送的其它參照聚合物、支鏈聚乙烯亞胺(pei)(aldrich，參照號40872-7)(聚合物60)，進行細胞毒性研究。
(a)針對按照本發明的陽離子聚合物的研究
制備陽離子聚合物
將陽離子聚合物溶于水中，并適當地在細胞培養介質中稀釋，以獲得10至10-5mg/ml的最終濃度，在24、48和72小時后，用于評價針對以下兩個細胞系的細胞毒性：monomac-6和ht29。
monomac-6細胞系
人類單核/巨噬細胞系monomac-6由mantovani教授(humanitas，意大利)友好地捐贈。
將細胞保持在37℃下含有5％co2的細胞培養器中，在補充有10％胎兒小牛血清(fcs)、2％l-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素溶液、1％非必需的氨基酸、1％100mm丙酮酸鈉和1％草酰乙酸的rpmi1640介質中。
將在懸浮液中生長的細胞維持在培養物中，通過經由細胞培養基在新鮮的完全培養基中1:4的稀釋，以每周一次頻率，進行傳代。
ht-29細胞系
將從americantypeculturecollection(atccmaryland,usa)獲得的人類結腸腺癌細胞系ht-29，維持在dulbecco'smodifiedeagles介質(dmem高葡萄糖ph7.4)中，該介質補充有10％胎兒小牛血清(fcs)、2％l-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素溶液、1％非必需氨基酸、1％100mm的丙酮酸鈉和2％1m的hepes溶液。
將通過粘附生長的細胞維持培養，通過在每周每個燒瓶接種300000個細胞的頻率下，在用胰蛋白酶/edta處理以從單層中移除細胞之前進行傳代。
細胞毒性分析
將在實驗前24小時鋪板在96孔板(10000細胞/孔)中的monomac-6和ht-29細胞，與各個濃度下的陽離子衍生物一起孵育24、48和72小時。
在用測試化合物處理結束時，使用試劑盒atplite(perkin-elmer)來確定細胞的生存力，其為腺苷三磷酸(atp)生產量。
atplite分析是基于發光的產生，發光是在存在于細胞中的atp與在讀數之前加入到孔中的熒光素酶和d-熒光素的反應產生的。產生的發光強度與存在于樣品中的atp濃度直接成正比，并且利用發光計(victor-3wallac)測量。
在進行發光計測量之前，向每個孔中加入在100μl培養基中50μl的溶胞溶液(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)。在室溫下孵育并在700rpm下攪拌5分鐘后，向每個孔加入50μlatplite試劑盒，在攪拌5分鐘后，將板在黑暗中再孵育10分鐘，之后進行發光測量。
對于每種衍生物，一式兩份地進行試驗。
通過考慮處理的細胞的發光值和未處理的對照細胞的發光值的平均值，來確定細胞生存力的百分比。
對于每種衍生物的細胞生存力百分比(％cv)，表示為相對于對照物(control)的平均百分比，按照下列等式：
當生存力的百分比小于50％時，化合物被認為是細胞毒性的。
表13-陽離子聚合物濃度0.01mg/ml
(*)用于比較的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝聚乙烯亞胺(pei)。
表13中的結果，使得可能表明：按照本發明的陽離子聚合物，在0.01mg/ml的濃度下，不是細胞毒性的。
表14-陽離子聚合物濃度0.1mg/ml
(*)用于比較的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝pei。
表14中的結果，使得可能表明：按照本發明的陽離子聚合物，在0.1mg/ml的濃度下，不是細胞毒性的，與deae-葡聚糖和pei不同。
表15-陽離子聚合物濃度1.0mg/ml
(*)用于比較的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝pei。
表15中的結果，使得可能表明：按照本發明的陽離子聚合物，除了聚合物7之外，在1mg/ml的濃度下，不是細胞毒性的，與deae-葡聚糖和pei不同。衍生物7被證明只在懸浮液中對細胞培養物是細胞毒性的。
表16-陽離子聚合物濃度10.0mg/ml
(*)用于比較的聚合物：
18＝deae葡聚糖；
50＝未改性的polglumyttm糖原；
60＝pei。
表16中的結果使得可能表明：按照本發明的陽離子聚合物，在10mg/ml的濃度下，不是細胞毒性的，不像deae-葡聚糖和pei。
(b)針對按照本發明的陽離子聚合物的熒光衍生物的研究
還利用按照本發明的陽離子聚合物的熒光衍生物進行細胞毒性研究，以確定最高非細胞毒性濃度(在該濃度下進行細胞攝取(uptake)研究)的目的。
如下來合成按照本發明的陽離子聚合物的熒光衍生物。
在不存在光的情況下，在裝備有磁力攪拌器的兩頸圓底燒瓶中，將500mg按照本發明的陽離子聚合物的一種溶解在10ml蒸餾水中。加入2ml1n的naoh，并將混合物在室溫下攪拌1.5小時。然后，加入溶解在約0.3mldmso中的36mg異硫氰酸熒光素(fitc)。將混合物在室溫下攪拌整夜。
次日，將20ml丙酮注入反應燒瓶中，并且在攪拌約30分鐘后，使聚合物沉淀。丟棄上層清液，并將沉淀物用約20ml丙酮洗滌兩次。
然后，將沉淀物溶解在約10ml蒸餾水中，隨后在再生纖維素管(截止(cut-off)15000)中反蒸餾水進行透析，在不存在光的情況下。一旦完成透析，將獲得的溶液通過0.45μm過濾器過濾并凍干。
針對如之前描述而制備的ht29粘附細胞，進行這些研究。
結果示于下表17中，其中按照本發明的陽離子聚合物的熒光衍生物，已經通過與表2中相同的編碼外加"f"進行表示。
表17
(*)比較的：
18f＝deae-葡聚糖的熒光衍生物
從獲得結果可以看出：最高濃度是1mg/ml，在內所述濃度所有按照本發明的陽離子聚合物的熒光衍生物，在24小時周期內是非細胞毒性的。相反，deae-葡聚糖的熒光衍生物在所有分析的濃度下都是高細胞毒性的。
實施例7
細胞攝取研究
利用本發明陽離子聚合物的熒光衍生物(1f-16f)和deae-葡聚糖鹽酸鹽，在1mg/ml的濃度下，即：在細胞毒性研究中分析的，熒光衍生物1f-16f被證明在24小時期間是非細胞毒性的最高濃度下，在2、6和24小時進行細胞攝取研究。
利用按照下列過程處理的ht29粘附細胞，進行研究。
將在試驗前一天在20000個細胞/孔的密度下析出的ht-29細胞，與各自的在1mg/ml濃度下的熒光衍生物一起孵育2、6和24小時。在每個孵育期的末尾，從孔中除去介質，并將細胞用標準的ph7.4磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)沖洗三次。
然后，用200μl溶胞溶液(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)處理細胞，并用熒光測定法(λexc.485nm；λem.535nm)測量熒光。
對于每個化合物和每次測試，計算兩個重復實驗的平均熒光，其數值示于表18中。
表18
通過構造每個熒光衍生物在溶胞溶劑(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)中的校準曲線，來計算熒光衍生物的細胞攝取有效量。
從校準曲線和觀察到的熒光強度，計算細胞攝取以mg/ml計的量，如在表19中所示。
表19
(*)熒光的deae-葡聚糖
獲得的結果表示：按照本發明的陽離子聚合物的細胞攝取度與deae-葡聚糖有關。
此外，值得注意的是：衍生度對細胞攝取具有直接成正比的影響。
實施例8
緩沖容量的評價
評價緩沖容量，以核對按照本發明的陽離子聚合物將具有以下特征，使得它們也將誘導"質子-海綿"效應，這被認為是在細胞吸收后，使聚合物-核酸復合物從核內體釋放所必需的。
將按照本發明的陽離子聚合物(deae-糖原)和deae-葡聚糖用naoh滴定，以轉變成鹽酸鹽(如實施例2所示)，通過ph變化來監測滴定。
將100mg聚合物鹽酸鹽溶解在100ml蒸餾水中，將溶液在室溫下攪拌整夜。次日，將溶液用0.01nnaoh滴定，用劑量計來進行滴定劑的添加，并且用ph計監測滴定。
針對按照本發明陽離子衍生物進行的滴定研究，使得可能標識在約4.5-8范圍內的低于和大約為生理學ph的pka分配，這賦予本發明陽離子聚合物以高的緩沖容量。
在大約生理學ph的pka值，對于賦予本發明陽離子聚合物以復合核酸所需的正電荷是有用的。
在低于生理學ph的pka值，對于確保復合物從核內體向細胞質中的釋放(通過"質子海綿"效應)是有用的。
圖9顯示：用于比較目的的陽離子聚合物2、3和4(deae-糖原，按照本發明)的滴定曲線。可注意到的是：同一種類的衍生物，緩沖容量隨著衍生度增加而增加。
另外，可以看出：聚合物4(deae-糖原)和產物18(deae-葡聚糖)具有相似的衍生度和可比較的緩沖容量，如在圖10中所示。
實施例9
流變性測量
針對按照本發明的陽離子衍生物1-16(deae-、dmap-、dmae-、2-oh-ptma-糖原)和deae-葡聚糖鹽酸鹽，在pbs中1％的濃度下，進行流變性研究。
利用bohlingemini150轉動流變儀進行測量，該流變儀是由bohlinr640.5.32軟件引導的，裝備有圓錐體-板幾何體2°/55mm，用peltierbohlin儀器保持恒溫在25℃下的，并且在"控制應力"模式下和1-5pa的剪切應力范圍中進行的。
所有分析的樣品顯示mpa*s等級的極低粘度值。這個特征使得還可能通過注射來使用根據本發明的陽離子衍生物。
舉例來說，表20報道了各個衍生物在單一應力值(2.5pa)下的粘度值。
表20
(*)比較的：deae-葡聚糖
實施例10
復合有陰離子分子的糖原的陽離子衍生物的細胞毒性研究
在實驗前一天，以10000個細胞/孔的密度，采用體積100μl的含有10％血清的dmem介質，鋪板ht-29細胞。
在試驗當天，從孔中除去介質，并加入150μl含有2.5％血清的dmem介質。然后，添加50μl由按照本發明的陽離子聚合物和熒光的sirna形成的復合物。由按照本發明的陽離子聚合物和熒光的sirna形成的復合物是按照以下操作制備的。
制備四種溶液，各自在40ml不含rnase的pbs中含有6.283mg陽離子聚合物3、7、11和15。向142.86μl各個溶液加入6.6μlsirna在不含rnase的pbs中的溶液(濃度20μm)，并且在幾分鐘后，將每個用350.54μl不含rnase的pbs稀釋。sirna在溶液中的最終濃度是264nm，相當于相對于聚合物重量為10重量％的sirna。
將由此獲得溶液攪拌約30秒，在室溫下孵育10分鐘，再次攪拌30秒，并靜置5分鐘。在進行試驗前，將溶液再次攪拌30秒。
將未添加sirna的陽離子聚合物3、7、11和15在40ml不含rnase的pbs中的溶液(50μl)，用作第一比較例。
將在sirna和轉染試劑
將未添加sirna的轉染試劑
將復合物和所有如上所述制備的比較材料被放置以與細胞接觸。
將細胞在37℃下培養4和24小時，之后除去上層清液，并加入100μl含有2.5％血清的介質。
在用測試化合物處理的末尾，以使用試劑盒atplite(perkin-elmer)確定細胞的生存力，其為腺苷三磷酸(atp)生產量的函數，如上文實施例6所描述的。
如在實施例6中所描述而確定的結果，在下表21中表示為活細胞的百分數。
表21
獲得的結果表明：在按照本發明的陽離子聚合物和sirna之間獲得的復合物不是細胞毒性的。
從而，將陽離子聚合物3、7、11和15用于以下的細胞攝取研究。
實施例11
復合有熒光陰離子分子的糖原的陽離子衍生物的細胞攝取研究
以與上文實施例7中描述的類似的方式進行該研究，利用ht29粘附細胞。
在實驗前一天，以20000個細胞/孔的密度，使用體積100μl的含有10％血清的dmem介質，鋪板ht-29細胞。
在試驗當天，從孔中除去介質，并加入150μl含有2.5％血清的dmem介質。然后，添加50μl由按照本發明的陽離子聚合物和熒光的sirna形成的復合物。
由按照本發明的陽離子聚合物和熒光的sirna形成的復合物是按照下列方法制備的。
制備四種溶液，各自在40ml不含rnase的pbs中含有6.2832mg陽離子聚合物3、7、11和15。向142.86μl每個這些溶液，加入6.6μlsirna在不含rnase的pbs中的溶液(濃度20μm)，并且在幾分鐘后，將每個用350.54μl不含rnase的pbs稀釋。sirna被熒光化合物alexa-488標記。sirna的最終濃度是264nm，相當于相對于聚合物重量為10重量％的sirna。
將由此獲得溶液攪拌約30秒，在室溫下孵育10分鐘，再攪拌30秒，并靜置5分鐘。在進行試驗前，將溶液再次攪拌30秒。
將在sirna和轉染試劑
測量單獨sirna的熒光，作為隨后的比較。
將復合物和所有如上所述制備的比較材料放置以與細胞接觸。
將細胞在37℃下孵育4小時，在舍棄上層清液之后，將細胞用200μlpbs沖洗兩次。
然后，在室溫與攪拌下，將細胞用200μl溶胞溶液(在0.2nnaoh中0.5％的tritonx-100)處理5分鐘。
在將聚合物和sirna之間形成的復合物已經與細胞保持接觸4小時之后，用熒光計(λexc.485nm；λem.535nm)測量由alexa-488標記的sirna(其被攝取)發射的熒光。
對于各個聚合物，一式三份地進行試驗，然后計算平均熒光強度。由這個值減去由單獨培養基計算的熒光強度平均值(它等于1366)，得到最終的熒光強度。
對第一比較例(
結果示于表22中。
表22
獲得的結果表明：按照本發明的陽離子聚合物能夠誘導sirna向細胞膜中的攝取。另外，與用作比較的復合物(包括
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