本發明屬于植物遺傳育種領域，具體涉及一套毛花獼猴桃和中華獼猴桃物種間雜交子代的鑒定引物，可加快獼猴桃育種進程。
背景技術：
獼猴桃（屬名：actinidia）為雌雄異株的大型落葉木質藤本植物，其果實口味俱佳，且具有豐富的營養價值，被譽為“水果之王”。目前，我國獼猴桃產量和面積均居世界第一，在世界獼猴桃產業中具有舉足輕重的地位。
原產于我國的獼猴桃共有52個種，具有廣泛的果實表型、品質特性和遺傳變異的豐富多樣性。常用于馴化、栽培和選育的物種有中華獼猴桃和毛花獼猴桃等。中華獼猴桃雌花多為單花，雄花多為聚傘花序，花為白色。果實多為褐色，果面被短茸毛，成熟時脫落，平均果重約20-120g，風味甜，余味酸，質嫩，汁多。毛花獼猴桃，雌雄花均為多歧聚傘花序，花為紅色。果實果面被長白色茸毛，果皮綠色，果肉青綠色，細致，果重約10-40g，風味甜酸，有青草香氣味，果實維生素c含量極高，是培育高維生素c含量物種的特殊種質資源。
在新物種培育過程中，以果形美觀、優質耐貯、豐產和抗逆等為育種目標，常選擇多個獼猴桃物種或種類進行雜交，從雜交子代中選出具有優良性狀的個體進行培育。一個關鍵的環節是準確辨別所有子代個體的遺傳背景。然而，基于形態特征的子代判別存在一定的缺陷，如周期長、子代早期的物種特征性狀不明顯等。分子鑒定方法具有操作簡單、穩定、不受環境影響等優點，在遺傳背景鑒定中具有重要意義，從而加快新種質的培育。常用的分子標記有葉綠體和線粒體標記，其中，葉綠體標記屬于父系遺傳，線粒體標記屬于母系遺傳，這兩類標記可組合一起進行親本關系鑒定。
技術實現要素：
本發明的目的是開發一套獼猴桃物種間雜種子代的鑒定引物，適用于鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃雜交子代是否為真實的雜種后代，在童期就可以開展分子鑒定、節省育種成本。
本發明的目的是這樣實現的：
一、一套鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃獼猴桃物種間雜交子代的引物
本發明通過比較毛花獼猴桃和中華獼猴桃的葉綠體和線粒體基因組序列，開發出一套用于鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃雜交子代的引物，分別包含葉綠體和線粒體分子標記的3對引物：
葉綠體標記引物為：
1）trnt-nl：
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2）trnl-nf：
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3）pid1：
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線粒體標記引物為：
1）kiwi-mt7：
f：5’-aaggcaagggtactgactgc-3’，
r：5’-ctttgaaacatgggccggtg-3’；
2）kiwi-mt18：
f：5’-gtaaagaaccaccccgagca-3’，
r：5’-ggattgctcttttcgacggc-3’；
3）kiwi-mt22：
f：5’-tctgcacgcatgagaccatt-3’，
r：5’-ccaccaagggcttactccag-3’。
二、一種準確快速鑒定毛花獼猴桃和中華獼猴桃物種間雜交子代的方法
本方法在童期就可以開展分子鑒定、節省育種成本、且不受環境影響。
本方法包括以下步驟：
①待檢測個體及親本基因組dna的提取：利用ctab法從毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測樣品樹皮中提取基因組dna；
②pcr擴增：以權利要求1所述6個引物對為擴增引物，以上一步驟提取的基因組dna為模板，進行pcr擴增反應；pcr反應體系為50μl，包含dna模板30～50ng，正/反向引物各0.25μm，2×pcrmastermix25.0μl，ddh2o補足至50μl；pcr反應參數為：94℃預變性4min；35個循環：變性，94℃、35s，退火，54℃、35s和延伸，72℃、40s；72℃終延伸4min；
③dna測序：將上述pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增子大小參考seqidno：1-6，以每對引物的上游引物為測序引物，對pcr產物進行測序，獲得毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測樣品的6個片段的dna序列；
④序列分析：利用clustaw軟件分別對每個擴增片段的測序序列進行比對，統計親本和待檢測子代所有變異位點的基因型；
⑤雜交子代的鑒定：根據葉綠體父系遺傳和線粒體母系遺傳的規律，判別子代是毛花獼猴桃和中華獼猴桃的雜交后代，真實子代的葉綠體標記基因型與父本完全相同，線粒體標記基因型與母本完全相同。
與現有技術相比，本發明具有操作簡單、重復性好、不受環境影響等優點，可節省育種成本及加快獼猴桃育種進程。
附圖說明
圖1為3個葉綠體分子標記和3個線粒體分子標記在毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測子代中的基因分型；
所展示的2個子代的葉綠體標記基因型與毛花獼猴桃相同，線粒體標記基因型與中華獼猴桃相同，因此，子代被鑒定為以毛花獼猴桃為父本、中華獼猴桃為母本的雜交子代。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例詳細說明。
實施例中所用材料為：用于雜交育種的親本毛花獼猴桃和中華獼猴桃，及2個候選雜交子代品種，即滿天紅和紅花金果。
1、分子標記開發及引物設計
對毛花獼猴桃和中華獼猴桃的葉綠體基因組序列進行線性比對，鑒定出葉綠體和線粒體基因組變異位點；分別隨機挑選3個葉綠體和線粒體基因組變異位點進行引物設計，設計參數和要求如下：（1）上下游引物序列離變異位點至少有100bp；（2）引物序列長度控制在18～25bp；（3）引物序列gc含量為30%～70%；（4）退火溫度范圍在52℃-63℃；（5）擴增的pcr產物長度為500～1000bp。最終我們篩選獲得3對線粒體和3對葉綠體引物，其序列見下表：
2、基因組dna提取
利用ctab法從毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測子代的樹皮樣本中提取基因組dna，步驟如下：（1）用液氮對新鮮樹皮進行研磨，并轉移至2ml離心管中；（2）向離心管中加入1ml60℃預熱的洗液，震蕩搖勻后，10000rpm離心10min，去上清；（3）向離心管中加入1ml60℃預熱的3×ctab提取緩沖液，60℃水浴60min，然后10000rpm離心8min，取上清至另一新的2ml離心管中；（4）加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），震蕩搖勻10min，12000rpm離心10min，取上清至另一新的2ml離心管中；（5）向離心管中加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1），震蕩搖勻10min，12000rpm離心10min，取上清至另一新的2ml離心管中；（6）加入等體積的預冷的異丙醇和1/10體積的3mnaac，混勻后置于-20℃至少30min，10000rpm4℃離心10min，棄上清；（7）用預冷的75%乙醇清洗沉淀，然后干燥dna（自然風干或37℃風干）；（8）利用50μlte緩沖液溶解dna。
3、pcr擴增
以上述毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測子代的基因組dna為模板，分別以trnt-nl、trnl-nf、pid1、kiwi-mt7、kiwi-mt18、kiwi-mt22為擴增引物進行pcr反應。pcr反應體系為50μl，包含dna模板30～50ng，正/反向引物各0.25μm，2×pcrmastermix25.0μl，ddh2o補足至50μl；pcr反應參數為：94℃預變性4min；35個循環：變性，94℃、35s，退火，54℃、35s和延伸，72℃、40s；72℃終延伸4min。
4、dna測序
將上述pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增子大小參考seqidno：1-6。以每對引物的上游引物為測序引物，對相應的pcr產物進行sanger法測序，獲得毛花獼猴桃和中華獼猴桃及待檢測樣品的6個片段的dna序列。
5、序列分析和基因分型
分別對每個標記的所有樣品的序列進行比對，統計親本和待檢測子代所有變異位點的基因型；如圖1所示，葉綠體分子標記引物trnt-nl、trnl-nf、pid1擴增的片段序列中，分別發現有4、5和1個snp位點，且還存在插入缺失位點；線粒體分子標記引物kiwi-mt7、kiwi-mt18、kiwi-mt22擴增的片段序列中，分別發現有1、1和3個snp位點。
6、雜交子代鑒定
子代鑒定的理論依據為：葉綠體基因組為父系遺傳；線粒體基因組為母系遺傳。如圖1所示，滿天紅和紅花金果葉綠體標記的基因型全與毛花獼猴桃相同；線粒體標記的基因型全與中華獼猴桃相同；因此，所鑒定的滿天紅和紅花金果兩個品種確實為以毛花獼猴桃為父本、以中華獼猴桃為母本的雜交子代品種。
序列表
<110>中國科學院武漢植物園
<120>一套毛花獼猴桃和中華獼猴桃物種間雜交子代的鑒定引物
<140>
<141>
<160>18
<210>1
<211>532
<212>dna
<400>
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