本發明屬于酵母菌分離
技術領域：
，具體涉及一種從葡萄皮表皮快速分離酵母菌的方法。
背景技術：
：酵母菌是一種單細胞真核微生物，也是人類實踐活動中應用較早的一類微生物。酵母菌在自然界中的分布很廣，主要是生長在偏酸性的高糖環境中，在水果，蔬菜的表面和果園的土壤中較為常見，葡萄成熟時，葡萄皮上會粘附多種類型的天然釀酒酵母，釀酒師有時就用它來發酵。現在隨著技術的不斷成熟，釀酒師越來越多地利用從天然酵母中精挑細選出來的酵母菌株進行發酵，因為不同的釀酒酵母品種有其獨特的發酵特點，所產生的味道也各不相同。但是，傳統的分離方法只能分離出較少類型的酵母菌，這對于以葡萄皮為原料充分分離得到多種類型酵母菌來說，是遠遠不夠的。技術實現要素：為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種從葡萄皮表皮快速分離酵母菌的方法，能夠分離并鑒別得到多種酵母菌類型，大大擴展了產品種類。具體的，本發明提供的從葡萄皮表皮快速分離酵母菌的方法，具體包括如下步驟：s1：葡萄的采摘與運輸準備無菌口罩、無菌手套、無菌塑料盒子、無菌剪刀和低溫冷凍盒，操作人員佩戴無菌口罩和無菌手套，選擇新鮮健康的枝條，用無菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用無菌手套輕拿輕放入無菌塑料盒子內，快速轉入低溫冷凍盒，運輸回實驗室；s2：葡萄皮的獲得準備無菌手套、無菌手術刀、無菌鑷子和無菌離心管，在超凈工作臺內，戴上無菌手套，逐個摘下葡萄粒，用無菌手術刀在葡萄果實中部拉開一道1cm長的口子，用無菌鑷子夾住開口的兩端均勻用力撕下葡萄表皮，裝入無菌離心管中，備用；s3：葡萄表皮酵母菌的富集選用yepd液體培養基，加入若干顆葡萄表皮，在28℃恒溫搖床中，轉速為180rpm，震蕩培養48小時，得到葡萄表皮酵母菌富集液；s4：快速分離鑒別酵母菌制備分離鑒別培養基wl，直接梯度稀釋葡萄表皮酵母菌富集液，選擇10-3、10-4、10-5三個稀釋度，分別吸取100μl稀釋液，涂布在wl培養基上，在37℃倒置培養5天后觀察結果，直接根據菌落形態對酵母菌進行計數和形態學記錄。優選地，s3中，每20mlyepd液體培養基中加入8～10顆葡萄表皮。更優選地，所述葡萄表皮是在眾多葡萄表皮中隨機選擇得到的。優選地，每升yepd液體培養基包括以下組分：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，余量為蒸餾水，且yepd液體培養基的的ph為6.1。與現有技術相比，本發明的方法具有以下有益效果：(1)充分考慮人為或者使用物品、運輸過程對原料樣品產生的不利影響；(2)考慮到原料樣品的代表性和完整性，本申請使用的是從所有樣品中隨機挑選一定數量的顆葡萄表皮，較好代表了所有采集樣品的特點；(3)由于傳統的分離方法是先經過yedp培養基分離，然后再隨機挑選菌落做wl鑒別，這種方法因為挑選的隨機性，導致部分濃度低的菌群容易被漏掉，影響了結果的全面性，而本發明提供的方法，直接在wl培養基上進行分離和鑒別，一步到位，節約時間的同時也有效減少了被漏掉菌群的弊端。具體實施方式為了使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案能予以實施，下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，均按照本領域的常規方法和條件進行。實施例1本實施例一種從葡萄皮表皮快速分離酵母菌的方法，具體包括如下步驟：s1：葡萄的采摘與運輸，準備無菌口罩、無菌手套、無菌塑料盒子、無菌剪刀和低溫冷凍盒，操作人員佩戴無菌口罩和無菌手套，選擇新鮮健康的枝條，用無菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用無菌手套輕拿輕放入無菌塑料盒子內，快速轉入低溫冷凍盒，運輸回實驗室；這么做可以有效地避免外援引入的污染，減少由此帶來的誤差。s2：葡萄皮的獲得，準備無菌手套、無菌手術刀、無菌鑷子和無菌離心管，在超凈工作臺內，戴上無菌手套，逐個摘下葡萄粒，用無菌手術刀在葡萄果實中部拉開一道1cm長的口子，用無菌鑷子夾住開口的兩端均勻用力撕下葡萄表皮，備用；s3：葡萄表皮酵母菌的富集，選用yepd液體培養基，每升yepd液體培養基包括以下組分：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，余量為蒸餾水，且yepd液體培養基的的ph為6.1。量取20ml的yepd液體培養基，向其中加入從s2中隨機選取的10顆葡萄表皮，在28℃恒溫搖床中，轉速為180rpm，震蕩培養48小時，離心分離，得到葡萄表皮酵母菌富集液；s4：快速分離鑒別酵母菌，制備分離鑒別培養基wl(每升wl液體培養基含有如下成分：酵母浸粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，磷酸二氫鉀0.55g，氯化鉀0.425g，氯化鈣0.125g，硫酸鎂0.125g，氯化鐵0.0025g，硫酸錳0.0025g，溴甲酚綠0.022g)，直接梯度稀釋葡萄表皮酵母菌富集液，選擇10-3、10-4、10-5三個稀釋度，分別吸取100μl稀釋液，涂布在wl培養基上，在37℃下倒置培養5天后觀察結果，直接根據菌落形態對酵母菌進行計數和形態學記錄。對比例1本對比例從葡萄皮表皮分離酵母菌的傳統分離方法，具體方法為：采用從葡萄粉碎汁液取樣后梯度稀釋或葡萄完整果實無菌水震蕩培養48小時，洗脫液梯度稀釋涂布yepd平板，然后隨機挑選單菌落再在wl培養基平板進行鑒別。實施例1提供的從葡萄皮表皮快速分離酵母菌的方法與傳統分離方法相比，綜合考慮了人為或者使用物品、運輸過程對樣品產生的影響，在采樣過程中操作人員佩戴無菌口罩和無菌手套，選擇新鮮健康的枝條，用無菌剪刀剪去果穗的柄部，然后用無菌手套輕拿輕放入無菌塑料盒子內，快速轉入低溫冷凍盒，運輸回實驗室，避免了樣品污染和人為引入其他雜菌。同時在分離過程中，考慮到樣品的代表性和完整性，以新鮮的葡萄表皮為原料，在眾多原料中隨機挑選一定數量的葡萄表皮，較好代表了所有采集樣品的特點。并通過直接在wl培養基上進行分離和鑒別，一步到位，節約時間的同時也有效減少了被漏掉菌群的弊端。經檢測，實施例1和對比例1分離獲得的酵母菌的類型具體如下表1所示：表1實施例1和對比例1分離獲得的酵母菌的類型數量鑒別得到酵母菌類型對比例12實施例15由表1可以看出，采用實施例1提供的方法，能夠快速分離獲得酵母菌，且酵母菌類型的數量較傳統方法顯著增加。其中，對比例1中得到了兩種酵母分別為路德酵母和畢赤酵母，而實施例1中除了以上兩種酵母，還得到了紅酵母、釀酒酵母和伊薩酵母。以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，其保護范圍不限于此。本
技術領域：
的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明的保護范圍之內，本發明的保護范圍以權利要求書為準。當前第1頁12