一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液的制作方法

本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液。

背景技術：

近年來，隨著體外器官培養技術的發展，基于體外細胞培養構建的3d重組角膜上皮模型，在眼刺激風險評價領域表現出特有的趨勢，類似于人體角膜上皮的細胞三維結構，不僅可以更為真實的反映人體對化學物的響應，準確給出化學物刺激性的預測，對于化合物篩選的種類也具有更寬的應用范疇，不僅適用于化妝品原料的危害評價，還可以用于不同劑型的化妝品成品的危害評估。目前，角膜上皮細胞是構建體外三維角膜上皮組織模型最理想的種子細胞，但是，可用角膜組織的有限來源，加之角膜細胞自身短暫的生命周期以及快速的分化，使得角膜上皮細胞體外培養難度大，且非常耗時。所以開發多種其他種子細胞來構建角膜組織，研究發現口腔黏膜上皮細胞與角膜上皮細胞特征相似，可以用于構建角膜樣模型。

口腔黏膜上皮細胞的培養大多是參照皮膚kc的培養技術，早期多采用有血清培養基和組織塊法，血清成份占10-20%。souhtgaet等綜合分析了培養基中的各種成份對原代口腔黏膜上皮細胞生長分化的影響，研究發現含血清10%的培養基成纖維細胞生長明顯，對正常的口腔黏膜上皮細胞造成嚴重的污染，影響口腔黏膜上皮細胞在醫學領域的應用。隨后許多口腔黏膜上皮細胞的培養采用酶解培養法，即用胰酶和dispaseⅱ酶酶解方法分離口腔黏膜上皮細胞，然后以3t3作為滋養層的技術來進行的，但由于滋養細胞的存在影響試驗結果的分析。而且，許多研究者相信3t3細胞和人細胞共同培養有可能引起突變或異種蛋白對人kc的轉染，強調在選擇性手術中盡量不用滋養層培養上皮細胞。為了避免使用滋養層，人們開發了多種方法：如培養皿表面涂細胞基質成份；不同濃度的鈣和各種生物提取物的添加；促分裂物和微量元素的添加。例如，arehnoltibdnslev應用含10%血清的無滋養層培養方法培養口腔黏膜上皮細胞，但是結果顯示口腔黏膜上皮細胞僅可傳代兩次，細胞形成復層。

針對上述情況，許多學者正尋求和使用無血清培養液，目前已有商品化的無血清培養基如k-sfm和mcdb153。盡管在無血清體系中添加多種類型的細胞生長因子如egf、胰島素、牛垂體提取液、氫化潑尼松、轉鐵蛋白和霍亂毒素，但是遠遠不能滿足血清中復雜的營養成份，所以無血清培養體系下培養的口腔黏膜上皮細胞生長緩慢，原有的干細胞特性下降，容易出現老化現象，很難大量擴增，從而限制了其在大規模的組織工程構建中的應用。另外，無血清培養基缺乏通用性，一種無血清培養基只能做到為一種或少數幾種細胞株設計或優化出高密度生長或高水平目的產物表達的培養基。

技術實現要素：

本發明實施例提供了一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，針對含10%血清的無滋養層培養方法培養口腔黏膜上皮細胞時，最多可傳代兩代并復層化的問題，以及無血清培養體系下，口腔黏膜上皮細胞生長緩慢、原有的干細胞特性下降、容易出現老化現象、很難大量擴增等一系列問題，本發明實施例提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，既能夠滿足細胞增殖又不影響細胞分化，增加細胞的傳代代次，使得口腔黏膜上皮細胞的大量擴增，以滿足臨床和組織工程構建的需求。

為達到上述目的，本發明實施例采用如下技術方案：

本發明實施例提供一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液包括基礎培養液、血清、必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子。

本發明提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液中，基礎培養液均為k-sfm培養液或者mcdb153培養液或者f12/dmem培養液，其中，f12/dmem培養液是f12培養液和dmem培養液以體積比1:3的比例混合的。

本發明提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，包括基礎培養液、濃度為0.5%-5%的胎牛血清、濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉鐵蛋白、濃度為5-20ng/ml的表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ和bpe、濃度為5-20ng/ml的貼壁因子纖連蛋白以及濃度為1-5μm的細胞增殖分化調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2。

本發明還提供一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液的配制方法，包括以下步驟：

在k-sfm培養液或mcdb153培養液或體積比為1∶3的f12和dmem三種培養液中的任意一種中，依次添加濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉鐵蛋白、濃度均為5-20ng/ml的表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ和bpe、濃度為5-20ng/ml的貼壁因子纖連蛋白，以及濃度均為1-5μm的維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2。最后再添加0.5%~5%的胎牛血清后形成的。

本發明提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液的有益效果有：

（1）低濃度血清和其他細胞因子協同提供細胞生長的營養成份：

與無血清培養基相比，低濃度的血清能夠為細胞提供外界無法補充的未知的血清成份，從而避免了無血清培養體系下細胞生長緩慢，原有的干細胞特性下降，容易出現老化現象等弊端；與含10%血清的培養基相比，低濃度血清加外加其他細胞因子的方法既能提供充足的營養，保證細胞高密度增殖，又能避免口腔黏膜上皮細胞的過度分化，從而可以實現口腔黏膜上皮細胞的體外大規模擴增，用于組織工程模型的構建。

（2）多種細胞增殖分化的調節劑實現細胞增殖分化調節

本發明將維甲酸、甘醇酸、rock激酶抑制劑這三種作用機理各不相同的細胞增殖分化的調節因子共同添加到培養體系中，協同作用實現細胞增殖分化調節，從而使得細胞保持原有的特性，避免過度分化。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的不同培養體系下，p6代口腔黏膜上皮細胞增殖曲線的比較結果；

圖2為本發明實施例提供的不同培養體系下，原代口腔黏膜上皮細胞培養過程中細胞增殖分化指標ki67、profilaggrin、k13和k19蛋白的mrna水平比較結果；

圖3（a）為本發明實施例提供的不同培養基體系下培養的口腔黏膜上皮細胞所構建的角膜樣模型的組織學染色圖片一；

圖3（b）為本發明實施例提供的不同培養基體系下培養的口腔黏膜上皮細胞所構建的角膜樣模型的組織學染色圖片二。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行詳細地描述。

需要說明的是，本發明實施例中使用的k-sfm、f12/dmem、mcdb153均購自gibco公司，胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、纖連蛋白、cacl2、甘醇酸、維甲酸以及rock抑制劑y27632均購自sigma公司，bpe為本公司自行提取的。

實施例1

本發明實施例提供一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，包括基礎培養液、血清、必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子。

其中，血清為濃度為0.5%-5%的胎牛血清，必需補充因子包括濃度為5-15μg/ml的胰島素和轉鐵蛋白，細胞生長因子包括濃度均為5-20ng/ml的表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ和bpe、貼壁因子為濃度為5-20ng/ml的纖連蛋白、細胞增殖分化的調節因子為濃度均為1-5μm的維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2。

需要說明的是，基礎培養液為k-sfm培養液或者mcdb153培養液或者f12/dmem培養液，其中，f12/dmem培養液是f12培養液和dmem培養液以體積比1:3的比例混合的。

示例性的，在第一種可能的實現方式中，本發明實施例提供的含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液可以包括：

以f12/dmem（1:3）作為基礎培養液配制1l含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，具體步驟如下：

（1）在超凈工作臺中用無菌去離子水配制必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子的母液，其中胰島素和轉鐵蛋白的母液濃度均為15mg/ml，表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為20mg/ml，細胞增殖分化的調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm；

（2）將f12/dmem（1:3）粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然后將燒杯置于攪拌機上，攪拌2h待溶解后，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；

（3）在超凈工作臺中向上述步驟2所得基礎培養液中依次添加步驟1所得必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子的母液，使得胰島素和轉鐵蛋白的濃度為10μg/ml；表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為20ng/ml；維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為2.5μm，攪拌均勻；

（4）再添加濃度為1μm的cacl2，攪拌均勻；

（5）最后，在超凈臺中添加濃度為2%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中備用。

示例性的，在第二種可能的實現方式中，本發明實施例提供的含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液可以包括：

以k-sfm作為基礎培養液配制1l含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，具體步驟如下：

（1）在超凈工作臺中用無菌去離子水配制必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子的母液，其中胰島素和轉鐵蛋白的母液濃度均為15mg/ml，表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為20mg/ml，細胞增殖分化的調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm；

（2）將k-sfm粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然后將燒杯置于攪拌機上，攪拌2h待溶解后，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；

（3）在超凈工作臺中向上述步驟2所得基礎培養液中依次添加步驟1所得必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子的母液，使得胰島素和轉鐵蛋白的濃度為5μg/ml；表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為12ng/ml；維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為1μm，攪拌均勻；

（4）再添加濃度為5μm的cacl2，攪拌均勻；

（5）最后，在超凈臺中添加濃度為5%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中備用。

示例性的，在第三種可能的實現方式中，本發明實施例提供的含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液可以包括：

以mcdb153作為基礎培養液配制1l含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，具體步驟如下：

（1）在超凈工作臺中用無菌去離子水配制必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子的母液，其中胰島素和轉鐵蛋白的母液濃度均為15mg/ml，表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為20mg/ml，細胞增殖分化的調節因子維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632和cacl2的母液濃度為10mm；

（2）將mcdb153粉末培養基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然后將燒杯置于攪拌機上，攪拌2h待溶解后，用0.22μm的過濾器過濾除菌，得基礎培養液；

（3）在超凈工作臺中向上述步驟2所得基礎培養液中依次添加步驟1所得必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子的母液，使得胰島素和轉鐵蛋白的濃度為15μg/ml；表皮生長因子egf、胰島素生長因子igf-i、轉化生長因子tgfβ、bpe和貼壁因子纖連蛋白的濃度為5ng/ml；維甲酸、甘醇酸、rock抑制劑y27632的濃度為5μm，攪拌均勻；

（4）再添加濃度為2μm的cacl2，攪拌均勻；

（5）最后，在超凈臺中添加濃度為0.5%的胎牛血清，密封好后放置于4℃冰箱中備用。

實施例2

采用無血清培養基mcdb153、含10%血清的培養體系和本發明實施例提供的含血清培養液培養口腔黏膜上皮細胞，p6代口腔黏膜上皮細胞增殖曲線的比較研究：

實驗操作方法：

取生長狀況良好的p6代口腔黏膜上皮細胞，待口腔黏膜上皮細胞為80%～90%融合時，pbs清洗細胞，用胰蛋白酶37℃消化約2min，終止消化，然后平均分裝到兩個離心管中離心。分別采用本發明實施例提供的培養液、含10%血清的培養體系和無血清培養基mcdb153重懸細胞，并進行細胞計數，按照3e4的細胞量接種于24孔板，然后將孔板置于37℃5%co2培養箱中培養，每隔24h計數一次，連續計數5天，根據計數結果，繪制細胞生長曲線。

實驗結果顯示，采用本發明實施例提供的培養液培養的口腔黏膜上皮細胞的生長曲線接近于含10%血清的培養體系培養的細胞的增殖曲線，在接種第1d為細胞潛伏適應期，第2d開始生長曲線開始上升，第2～4d生長曲線基本為線性曲線，表明這段時間是細胞的對數生長期。第5d后曲線逐漸變得平緩，細胞增殖明顯減慢，進入平臺期，細胞生長曲線近似“s”形。無血清培養基mcdb153體系下培養的口腔黏膜上皮細胞在接種1d也為細胞潛伏適應期，第2天開始生長曲線開始上升，但上升速度明顯落后于本發明實施例提供的培養液（附圖1）。

實施例3

采用無血清培養基mcdb153、含10%胎牛血清的f12/dmem（1:3）培養基體系和本發明實施例提供的培養液培養原代口腔黏膜上皮細胞，細胞增殖分化相關蛋白含量變化的比較研究：實驗操作方法：

無菌條件下切取出生后1d的昆明小鼠口腔黏膜，修剪去除黏膜下組織并剪成約1mm×1mm大小的組織塊，用含雙抗的pbs沖洗3～4次。將標本放入4mg/mldispaseⅱ中，37℃消化約15min，然后分離上皮層。pbs輕輕沖洗上皮層后，置于0.25%胰蛋白酶中，37℃消化約10min，終止消化，吹打成單細胞懸液，離心棄掉上清后，分別接種于三種不同培養基體系的25ml培養瓶中，其中三種不同培養基體系分別為含10%胎牛血清的f12/dmem（1:3）培養基體系、無血清的mcdb153培養基體系和本發明實施例提供的的培養體系，然后置于37℃，5%co2培養箱培養，每2d更換1次培養液。培養至第7天時，對細胞分化標志物profilaggrin、細胞非角化蛋白k13和k19以及細胞增殖標志物ki67等蛋白的mrna含量進行分析。

結果顯示，與無血清培養基mcdb153相比，采用本發明實施例提供的培養液培養的口腔黏膜上皮細胞，其細胞增殖標志物ki67的mrna水平顯著性升高；與含10%血清的培養體系相比，采用本發明實施例提供的的培養液下的細胞分化標志物profilaggrinmrna水平顯著性降低，而細胞非角化蛋白k13和k19的mrna水平顯著性升高，同時細胞增殖的標志物ki67的mrna水平也有一定程度的升高，但沒有顯著性差異，主要原因是高濃度血清體系下，細胞的過度分化抑制了細胞的增殖（附圖2）。

實施例4

采用無血清培養基mcdb153和本發明實施例提供的培養液培養的p5代口腔黏膜上皮細胞用于構建角膜樣模型的比較研究：

復蘇p4代口腔黏膜上皮細胞，然后分別用本發明實施例提供的培養液和無血清培養基mcdb153培養擴增口腔黏膜上皮細胞，待口腔黏膜上皮細胞為80%～90%融合時，pbs清洗細胞，用胰蛋白酶37℃消化約2min，終止消化，離心棄掉上清液，然后采用培養液sk1重懸口腔黏膜上皮細胞，接種于細胞小室中液下培養，接種密度為0.2×105～0.5×105個/cm2，在5%co2、36～37℃的細胞培養箱中孵育24～48小時。

培養2～3d后，更換成構建培養液sk2，并進行氣液面培養，將細胞小室內的培養液吸去，保持構建模型表面的干燥，隨后在4.5%～5.5%co2、37±1℃的孵箱中培養2～3d，每天換液一次；

再培養2～3d后，更換成構建培養液sk3，并進行氣液面培養，在4.5%～5.5%co2、37±1℃的孵箱中培養2～3d，每天換液一次，得到體外重組角膜樣模型。

圖3（a）為本發明培養基培養的口腔黏膜上皮細胞構建的角膜樣模型的組織學染色圖片；圖3（b）為mcdb153培養基培養的口腔黏膜上皮細胞構建的角膜樣模型的組織學染色圖片。結果顯示，用無血清培養基mcdb153體系擴增的口腔黏膜上皮細胞構建的角膜樣模型出現空洞現象，主要原因是口腔黏膜細胞失去干細胞特性，細胞老化導致的，而相比之下，采用用本發明實施例提供的培養液擴增的口腔黏膜上皮細胞構建的角膜樣模型生長分化良好，沒有空洞現象（附圖3）。

本發明實施例提供一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，包括基礎培養液、血清、必需補充因子、細胞生長因子、貼壁因子以及細胞增殖分化的調節因子。針對含10%血清的無滋養層培養方法培養口腔黏膜上皮細胞時，最多可傳代兩代并復層化的問題，以及無血清培養體系下，口腔黏膜上皮細胞生長緩慢、原有的干細胞特性下降、容易出現老化現象、很難大量擴增等一系列問題，本發明實施例提供的一種含血清的口腔黏膜上皮細胞培養液，既能夠滿足細胞增殖又不影響細胞分化，增加細胞的傳代代次，使得口腔黏膜上皮細胞的大量擴增，以滿足臨床和組織工程構建的需求。

以上所述，僅為本申請的具體實施方式，但本申請的保護范圍并不局限于此，任何在本申請揭露的技術范圍內的變化或替換，都應涵蓋在本申請的保護范圍之內。因此，本申請的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。