本發明涉及組織工程
技術領域：
，尤其涉及一種屏障加強的體外重組表皮模型的構建方法。
背景技術：
：皮膚是人體與外界環境接觸的屏障，保護體內各種組織和器官免受物理性、機械性、化學性和病原微生物的侵襲。人體皮膚主要由三部分構成，即表皮層、真皮層和皮下組織。表皮層位于皮膚的最外層，由基底層、棘細胞層、顆粒細胞層和角質層構成。角質層是表皮細胞分化的最后產物，由角質形成細胞及其細胞間脂質基質組成，厚度大約為10μm，是皮膚屏障功能的主要結構，因此角質層的屏障功能一直是組織工程皮膚的主要研究課題，很多研究者在如何提高組織工程皮膚模型角質層屏障方面付諸了大量努力。近年來，有越來越多的證據表明細胞緊密連接對維持機體表皮正常結構及功能具有重要作用，承擔著部分皮膚屏障功能。緊密連接是一種細胞與細胞之間的連接結構，它的主要功能是：將表皮細胞緊密連接，使細胞不易受到破壞；控制分子的細胞旁通路，對分子大小、離子類型、細胞滲透性有選擇性，具有細胞間透過屏障功能；維持細胞的極性，分離細胞膜基底部分和胞膜頂部的脂質；緊密連接蛋白還參與信號轉導通路；此外，緊密連接可能還參與表皮鈣離子梯度（ca2+）形成和板層小體的極性分泌過程，是皮膚屏障功能的重要組成部分和關鍵調節因子。現有的組織工程皮膚模型產品雖然在一般的結構、組成和生物化學方面與人類皮膚具有高度相似性，可用于皮膚毒性測試，但其滲透性相比于人類皮膚仍然要高得多。造成模型屏障功能缺陷的因素除了脂質組成和板層結構上的異常外，可能還有細胞間連接結構的不完整，角質層正常脫落過程受損和非角化的微觀病灶的存在，這些方面的缺陷導致現有的重組表皮模型屏障功能不完善，限制了這些皮膚模型在皮膚吸收和滲透實驗等其他方面的應用。具有成纖維細胞真皮層和表皮層的全層皮膚模型雖然在組織結構上更類似于人體天然皮膚，并且能在一定程度上降低滲透性，但真皮層的加入又會引入其他影響，如在模型制備過程中，下層成纖維細胞的來源，數量以及狀態的差異性對于表皮細胞的增殖及分化有較大影響，造成模型穩定性差，影響模型對化學物質評判的準確性。另外由于成纖維細胞在體外分化的過程中，會自身分泌的膠原，對外界的膠原支架或者其他生物材料支架進行塑形，易導致真皮部分乃至模型收縮，引起測試物從模型邊緣的滲漏，干擾測試結果的評判；最后，成纖維細胞的存在也要求構建體系的培養液必須含有血清，引進了不可預估的安全風險。并且，模型構建工藝繁瑣，制備周期長，結構復雜。技術實現要素：本發明提供了一種屏障加強的體外重組表皮模型的構建方法，能夠從兩方面加強組織工程重建表皮模型的屏障功能，滿足皮膚吸收和滲透試驗要求，擴大了產品的應用范圍。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：本發明提供過一種屏障加強的體外重組表皮模型的構建方法，該方法包括以下步驟：1、表皮模型構建培養基配制：（1）表皮細胞培養液配制：以kc-growth培養液為基礎液，每500ml中添加l-谷氨酰胺1.0~1.5mm和牛垂體提取物12~25mg。（2）表皮細胞tu培養液：在（1）的基礎上添加表皮生長因子0.5~5μg、氫化可的松2~50μg、胰島素1~10mg、腺嘌呤5~25mg、轉鐵蛋白2.5~6μg、氯化鈣0.03~0.2mm。（3）表皮細胞ta培養液：在（2）基礎上，每500ml中添加脂質混合物（l-絲氨酸0.25～5mm、棕櫚酸0.4～5μm、亞油酸0.01~0.05mm、精氨琥珀酸0.025~0.05mm、牛血清白蛋白0.01~0.05mm）、巨噬細胞活化肽2(macrophage-activatinglipopeptidemalp2)2.5~5.0mg、維生素c15~25μg，調整氯化鈣濃度為1.0~1.5mm。2、表皮干細胞分離和培養：表皮干細胞分離：將人體皮膚組織置于培養皿中，加入75%酒精10ml，迅速進行沖洗，轉入pbs溶液中，用剪刀剝離去除皮下疏松結締組織，用pbs浸洗，將組織塊切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml質量比為1%的dispase消化液，4℃消化過夜，分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，再加入10ml質量比為0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分鐘，獲得分離成單個細胞的表皮細胞溶液，用200目不銹鋼篩網過濾表皮碎片，1000rpm離心7分鐘，去掉上層清液，用pbs洗滌下層細胞，然后1000rpm離心7分鐘，倒掉上清液，加入表皮細胞培養液，按2~4×106/瓶接種到iv型膠原包被的培養瓶中，37℃，5%co2培養箱中孵育10-15min，吸出培養基，更換新鮮表皮細胞培養液繼續培養，隔48h換一次液。3、組織工程表皮構建：將步驟2中獲得的表皮干細胞用胰酶消化液消化，用表皮細胞tu培養液制成密度為1×106~6×106個/ml的表皮干細胞分散液，取200μl接種于含有聚碳酸酯濾膜的細胞培養小室中，震蕩均勻，在37℃，5%co2培養箱中孵育20~30min。將接種后的細胞培養小室轉入表皮模型培養模具中，小室外的培養皿中加入新鮮表皮細胞tu培養液，37℃，5%co2培養箱繼續培養24~48h后，吸去細胞小室中的剩余培養基，將細胞培養小室升至氣液面，更換表皮細胞ta培養液，37℃5%co2培養箱繼續培養12~14天后可得具有形態分化完全的基底層、棘層、顆粒層、角質層的組織工程表皮模型。本發明采用表皮干細胞作為種子細胞，聚碳酸脂膜作為支架構建用于滲透試驗的屏障加強的重組表皮模型。表皮干細胞增殖和分化能力強，在無真皮層支持的條件下形成的表皮組織形態和結構完整、功能和活性體外維持時間較長；聚碳酸脂膜具有無毒性、生物相容性好的特點，以此為支架材料標準化程度高、批間差異小、生產周期短。本發明中還在氣液面培養階段中添加了脂質混合物和巨噬細胞活化肽2，脂質混合物的添加通過調節表皮細胞脂質合成，改善了角質層的脂質組成和屏障功能，同時巨噬細胞活化肽2通過調節緊密連接蛋白的表達，增強緊密連接滲透屏障，從兩方面加強組織工程重建表皮模型的屏障功能，能夠滿足皮膚吸收和滲透試驗要求，擴大了產品的應用范圍。附圖說明圖1為本發明實施例提供的皮膚刺激性體外重組表皮模型和屏障加強的重組表皮模型組織學染色結果對比圖。具體實施方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行詳細地描述。實施例1本發明實施例提供一種屏障功能加強的體外重組表皮模型構建方法，具體包括以下步驟：1、表皮模型構建培養基配制：表皮細胞培養液配制：以kc-growth培養液為基礎液，每500ml中添加l-谷氨酰胺1.0~1.5mm和牛垂體提取物12~25mg。表皮細胞tu培養液：在（1）的基礎上添加表皮生長因子0.5~5μg、氫化可的松2~50μg、胰島素1~10mg、腺嘌呤5~25mg、轉鐵蛋白2.5~6μg、氯化鈣0.03~0.2mm。表皮細胞ta培養液：在（2）基礎上，每500ml中添加脂質混合物（l-絲氨酸0.25～5mm、棕櫚酸0.4～5μm、亞油酸0.01~0.05mm、精氨琥珀酸0.025~0.05mm、牛血清白蛋白0.01~0.05mm）、巨噬細胞活化肽2(macrophage-activatinglipopeptidemalp-2)2.5~5.0mg、維生素c15~25μg，調整氯化鈣濃度為1.0~1.5mm。2、表皮干細胞分離和培養：表皮干細胞分離：將人體皮膚組織置于培養皿中，加入75%酒精10ml，迅速進行沖洗，轉入pbs溶液中，用剪刀剝離去除皮下疏松結締組織，用pbs浸洗，將組織塊切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml質量比為1%的dispase消化液，4℃消化過夜，分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，再加入10ml質量比為0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分鐘，獲得分離成單個細胞的表皮細胞溶液，用200目不銹鋼篩網過濾表皮碎片，1000rpm離心7分鐘，去掉上層清液，用pbs洗滌下層細胞，然后1000rpm離心7分鐘，倒掉上清液，加入表皮細胞培養液，按2~4×106/瓶接種到iv型膠原包被的培養瓶中，37℃，5%co2培養箱中孵育10~15min，吸出培養基，更換新鮮表皮細胞培養液繼續培養，隔48h換一次液。3、組織工程表皮構建：將步驟2中獲得的表皮干細胞用胰酶消化液消化，用表皮細胞tu培養液制成密度為1.25×106個/ml的表皮干細胞分散液，取200μl接種于含有聚碳酸酯濾膜的細胞培養小室中，震蕩均勻，在37℃，5%co2培養箱中孵育20~30min。將接種后的細胞培養小室轉入表皮模型培養模具中，小室外的培養皿中加入新鮮表皮細胞tu培養液，37℃，5%co2培養箱繼續培養48h后，吸去細胞小室中的剩余培養基，將細胞培養小室升至氣液面，更換表皮細胞ta培養液，37℃5%co2培養箱繼續培養14天后可得具有形態分化完全的基底層、棘層、顆粒層、角質層的組織工程表皮模型。實施例2本發明實施例提供一種屏障功能加強的體外重組表皮模型構建方法，具體包括以下步驟：1、表皮模型構建專用培養基配制：表皮細胞培養液配制：以kc-growth培養液為基礎液，每500ml中添加l-谷氨酰胺1.0~1.5mm和牛垂體提取物12~25mg。表皮細胞tu培養液：在（1）的基礎上添加表皮生長因子0.5~5μg、氫化可的松2~50μg、胰島素1~10mg、腺嘌呤5~25mg、轉鐵蛋白2.5~6μg、氯化鈣0.03~0.2mm。表皮細胞ta培養液：在（2）基礎上，每500ml中添加脂質混合物（l-絲氨酸0.25～5mm、棕櫚酸0.4～5μm、亞油酸0.01~0.05mm、精氨琥珀酸0.025~0.05mm、牛血清白蛋白0.01~0.05mm）、巨噬細胞活化肽2(macrophage-activatinglipopeptidemalp-2)2.5~5.0mg、維生素c15~25μg，調整氯化鈣濃度為1.0~1.5mm。2、表皮干細胞分離和培養：表皮干細胞分離：將人體皮膚組織置于培養皿中，加入75%酒精10ml，迅速進行沖洗，轉入pbs溶液中，用剪刀剝離去除皮下疏松結締組織，用pbs浸洗，將組織塊切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml質量比為1%的dispase消化液，4℃消化過夜，分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，再加入10ml質量比為0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分鐘，獲得分離成單個細胞的表皮細胞溶液，用200目不銹鋼篩網過濾表皮碎片，1000rpm離心7分鐘，去掉上層清液，用pbs洗滌下層細胞，然后1000rpm離心7分鐘，倒掉上清液，加入表皮細胞培養液，按2~4×106/瓶接種到iv型膠原包被的培養瓶中，37℃，5%co2培養箱中孵育10~15min，吸出培養基，更換新鮮表皮細胞培養液繼續培養，隔48h換一次液。3、組織工程表皮構建：將步驟2中獲得的表皮干細胞用胰酶消化液消化，用表皮細胞tu培養液制成密度為2.5×106個/ml的表皮干細胞分散液，取200μl接種于含有聚碳酸酯濾膜的細胞培養小室中，震蕩均勻，在37℃，5%co2培養箱中孵育20~30min。將接種后的細胞培養小室轉入表皮模型培養模具中，小室外的培養皿中加入新鮮表皮細胞tu培養液，37℃，5%co2培養箱繼續培養48h后，吸去細胞小室中的剩余培養基，將細胞培養小室升至氣液面，更換表皮細胞ta培養液，37℃5%co2培養箱繼續培養12天后可得具有形態分化完全的基底層、棘層、顆粒層、角質層的組織工程表皮模型。實施例3體外重組表皮模型在化學品皮膚吸收滲透實驗中的用途，其使用方法如下：1、皮膚預處理選用健康的人體腹部皮膚，仔細剔除皮下黏膜和脂肪組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干皮膚表面生理鹽水，解剖鏡下選取適當大小未損傷的皮膚備用。體外重組表皮模型（刺激模型），屏障加強表皮模型（滲透模型）分別在氣液面培養10或14天，用來做滲透試驗。實驗前檢查人體皮服和表皮模型的完整性，確保屏障沒有任何損傷。2、經皮滲透實驗（1）采用franz擴散池進行透皮試驗（有效滲透面s為0.196cm2，接收池容積為4.1ml），將人體皮膚或表皮模型固定于供給室和接收池之間，皮膚角質層面向供給室，真皮層一側朝向接受池；接收液為pbs液、ph=7.4，接受液液面要與皮膚內層接觸；保持32±1℃恒溫水浴，并確保水浴夾層無氣泡，開啟電磁攪拌器以600rpm/min的速度攪拌。（2）將樣品加至供給室中（一般固體樣品添加量為1~5mg/cm2，液體最多添加量為10μl/cm2）于1h、2h、4h、8h、16h、24h取出接收液0.3ml(每次取樣后均補加等量的接受液)，將取得的樣品進行離心，取上清液，再用0.45μm濾膜過濾.（3）將過濾液用hplc測定樣品含量。液相色譜條件見下表1。表1樣品hplc檢測條件樣品流動相流速(ml/min)檢測波長(nm)溫度咖啡因乙腈：水：甲醇（10:70:20v/v/v）127025℃氫化可的松乙腈：水：(40:60v/v)124225℃3、樣品對照品標準曲線的制定精密稱量一定質量的對照品置于棕色容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液，低溫避光保存備用。測試時，按一定濃度梯度倍比稀釋，色譜條件下進樣分析，記錄標準品色譜峰面積。以色譜峰面積y對標準品濃度c(μg·ml-1)進行線性回歸。同時實驗過程中要排除皮膚溶出物/空白基質在樣品保留時間時沒有吸收峰，排除樣品測定的干擾。4、計算累積透皮量q，公式如下：q=[cn×v+∑ci×v0]/s(i=1…n-1)q：累積滲透量；s：有效擴散面積；v：接收室中接收液體積；v0：每次取樣的體積；ci：第1次至上次取樣時接收液中藥物濃度；cn：該次取樣時接收液中藥物濃度。此外透皮速率和遲滯時間根據累積滲透量對時間的斜率計算得到，其中將單位面積藥物累積透過量(μg/cm2)對時間作圖，直線部分的斜率即為穩態通透速率(j,μg/cm2/h)，直線與x軸的交點為時滯(t,h)；藥物的滲透系數(kp,cm/h)則是穩態通透速率(j)與藥物在供給液中溶解度(cs，mg/ml)的比值，滲透系數根據fick’s第一擴散定律（j=kpcs）計算得到。兩種樣品在人體皮膚、體外重組表皮模型和屏障加強的體外重組表皮模型上的滲透測試結果見表2，從表中可以看出通過本發明構建的表皮模型，具有更強的屏障功能，對兩種滲透標準品（咖啡因和氫化可的松）的滲透性雖然仍高于人體皮膚，但相比于優化前的表皮模型，滲透性顯著降低。表2樣品在三種皮膚替代物上的24h體外滲實驗結果參見圖1，可以看出，體外重組表皮模型和屏障加強的重組表皮模型組織學染色結果對比圖，從he染色圖中可以看出采用本發明構建的屏障加強的重組表皮模型具有更厚的角質層，屏障功能更強。盡管以上結合附圖對本發明的實施方案進行了描述，但本發明并不局限于上述的具體實施方案，上述的具體實施方案僅僅是示意性的、指導性的，而不是限制性的。本領域的普通技術人員在本說明書的啟示下，在不脫離本發明權利要求所保護的范圍的情況下，還可以做出很多種的形式，這些均屬于本發明保護之列。當前第1頁12