一種提取動物細胞核內染色質及其相關蛋白的方法與流程

本發明涉及一種提取動物細胞核內染色質及其相關蛋白的方法。

背景技術：

細胞是一切生命活動的基本結構和功能單位。動物細胞的基本結構包括細胞質膜，細胞核，細胞質。細胞質膜是指圍繞在細胞最外層，由脂質、蛋白質和糖類組成的生物膜，在結構上作為細胞的界限，使細胞具有一個相對穩定的內環境，同時可以介導細胞與環境之間的物質運輸、能量轉換及信息傳遞等過程。細胞質是指細胞質膜包圍的除核區外的一切半透明、膠狀、顆粒狀物質的總稱，由細胞質基質、內膜系統、細胞骨架和包含物組成，細胞質是生命活動的主要場所。細胞質包括基質、細胞器和后含物，在生活狀態下為透明的膠狀物。基質是指細胞質內呈液態的部分，是細胞質的基本成分，主要含有多種可溶性酶、糖、無機鹽和水等。細胞器是分布于細胞質內、具有一定形態、在細胞生理活動中起重要作用的結構，包括線粒體、質體，內質網、高爾基體、溶酶體、細胞骨架（微絲、微管、中間纖維）、中心粒以及周圍物質等。

細胞核是動物細胞內最大、最重要的細胞器，是細胞遺傳與代謝的調控中心。細胞核主要由核被膜、核纖層、染色質、核仁及核體組成。細胞核是遺傳信息的儲存場所，與細胞遺傳及代謝活動密切相關的基因復制、轉錄和轉錄初產物的加工過程均在此進行。染色質作為遺傳物質的載體，是指間期細胞核內由dna、組蛋白、非組蛋白及少量rna組成的線性復合結構。染色質是細胞遺傳與代謝調控中心的最重要成員，幾乎所有細胞生命活動都要從染色質開始。與基因組直接相關的細胞活動都是在染色質水平進行，如dna復制、基因轉錄、同源重組、dna修復，包括轉錄偶聯的修復以及dna和組蛋白的各種修飾。與染色質dna結合的蛋白質負責dna分子遺傳信息的組織、復制和閱讀。這些dna結合蛋白包括兩類：一類是組蛋白，與dna結合但沒有序列特異性；另一類是非組蛋白，與特定的dna序列或組蛋白相結合。

目前從組織或細胞全裂解液中分離提取染色質及其相關蛋白比較困難，沒有較好的方法，本發明提供了一種能夠快速簡便提取染色質及其相關蛋白的方法，對于細胞核內各組分重要功能的研究具有重要意義。

技術實現要素：

本發明所提出的一種提取動物細胞核內染色質及其相關蛋白的方法，目的在于填補提取染色質及其相關蛋白這一領域的空白。

本發明是按照以下技術方案實現的。

一種提取動物細胞核內染色質及其相關蛋白的方法，包括以下步驟：

a.收集細胞

棄去培養液，使用稀釋后的0.25%的胰酶溶液進行常規細胞消化，離心棄上清，保留細胞沉淀，用適量pbs重懸細胞沉淀，離心棄上清，保留沉淀；

b.細胞勻漿裂解

（1）向步驟a所得沉淀中加入buffer1，震蕩后冰浴2-5分鐘；

（2）將細胞懸液轉移到預冷的玻璃勻漿器內，冰上勻漿50-60次左右后冰上靜置1-2h；

（3）600-800g，4℃離心5-10分鐘，得到的沉淀即粗細胞核組分；

（4）吸取步驟b（3）所得上清，600-800g，4℃，5-10分鐘，反復多次離心，直至沒有沉淀，最終得到的上清即為胞漿和胞膜的混合組分；

c.細胞核的制備

用適量buffer1重懸步驟b（3）得到的粗核，離心棄上清；重復上述離心過程4-5次，最終得到的沉淀即為完整且純度較高的細胞核組分；

d.細胞染色質及其相關蛋白的分離

（1）用適量的buffer2溶解細胞核組分，冰浴30-60min，離心，獲得沉淀和上清，上清即為核內可溶性組分；

（2）將步驟d（1）得到的沉淀用buffer2重懸，離心，棄去上清，重復離心2-3次，最終得到的沉淀即為細胞核內不溶性的染色質組分；

e.染色質相關蛋白的檢測

（1）胞漿和胞膜的混合組分以及核內可溶性組分：根據上清體積加1/3體積的三氯醋酸水溶液，-20℃過夜。第二天取出，4000-5000g，4℃離心5-10分鐘，棄上清，冰上干燥后加入1×sds細胞裂解液，4℃裂解蛋白；

（2）細胞核組分以及細胞核內不可溶性的染色質及其相關蛋白組分：直接加入1×sds細胞裂解液，4℃裂解蛋白；

上述組分蛋白裂解后加熱變性，測蛋白濃度，進行westernblot檢測。

所述步驟a中使用稀釋后的0.25%的胰酶溶液進行常規細胞消化，1000rpm，離心5-10分鐘后棄上清，保留細胞沉淀，用適量pbs重懸細胞沉淀，800-900g，離心5-10分鐘后棄上清，保留沉淀。

所述步驟b（1）中按照每1×10⁷個細胞加500-600μl體積的比例加入適量的buffer1。

所述步驟c中用適量buffer1重懸步驟b（3）得到的粗核，4000-5000g，4℃離心5-10分鐘，棄上清；

所述步驟d（1）和d（2）低速離心條件為1700-2000g，5-10分鐘，4℃。

本發明獲得了如下有益效果：

使用本發明所述方法獲得的純度較高的染色質及其相關蛋白，不含有胞漿和胞膜成分。解決了目前提取染色質及其相關蛋白比較困難的問題，為染色質及其相關蛋白的功能研究提供了實驗基礎，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1是本發明實驗方法流程圖；

圖2是westernbloting檢測本發明所述方法獲得的各組分中內參蛋白表達圖。

具體實施方式

為了進一步闡釋本發明的技術方案及其所實現的技術效果，以人乳腺癌細胞系mda-mb-231為例，下面將結合附圖及實施例對本發明進行進一步的說明。

本發明實驗方法流程圖參見圖1。

一、溶液的配置

（1）buffer1：含10mmhepes（ph為7.9），1.5mmmgcl2，0.34m蔗糖，10%甘油，1mm二硫蘇糖醇和磷酸酶抑制劑。

（2）buffer2：含有3mmedta，0.2mmegta，1mm二硫蘇糖醇，以及磷酸酶抑制劑。

（3）500mmhepes溶液配方：天平稱取hepes粉末5.9575g，溶于40ml的ddw中。再用0.5mnaoh溶液調整ph值至7.9，用ddw定容到50ml即可。使用前稀釋到指定濃度。

二、實驗方法及結果

使用人乳腺癌細胞系mda-mb-231進行以下實驗。人乳腺癌細胞系mda-mb-231構自美國atcc（americantypeculturecollection）細胞庫，細胞使用dmem培養基（添加10%的胎牛血清fbs、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素）培養。細胞置于37℃細胞培養箱，5%co2的環境中培養。培養液用量為每10cm培養皿使用10ml含血清培養液。

1.收集細胞

首先棄去培養液，再用常溫的pbs溶液清洗培養皿3次，用無菌移液管吸去殘留液體。使用稀釋后的0.25%的胰酶溶液（優選1：3稀釋）進行常規細胞的消化過程，約1分鐘。終止細胞細化后，將細胞懸液轉移到離心管中，800g離心10分鐘。棄去上清，得到細胞沉淀。

2.對細胞進行勻漿裂解

（1）按照每1×10⁷個細胞加500μl體積的比例加入適量的buffer1。首先震蕩混合液使得細胞充分重懸，再行冰浴2分鐘。

（2）將細胞重懸液轉移到冰上預冷的玻璃勻漿器內（2mldounce勻漿器，每個勻漿器最多加500μl懸液），在冰上進行上下方向的手動勻漿約50次左右，之后在冰上靜置一小時左右（注意：破碎細胞是提取細胞成分的關鍵環節，有效的研磨方式是上下方向的推拉研磨）。

（3）將勻漿器內的細胞裂解混合物轉移到預冷的1.5mlep管中。再以800g，4℃離心5分鐘。此時得到的沉淀則是細胞核的粗制品。

（4）吸取上清并轉移到新的預冷ep管中。800g，4℃，5分鐘多次離心，直至上清離心后管底無肉眼可見沉淀，此時最終得到的上清則是胞漿和胞膜的混合組分（上清1）。3.細胞核的制備

3.加入與2（1）等量的buffer1于步驟2（3）得到的粗核沉淀中，混合均勻。再以4000g，4℃離心5分鐘后，棄上清。重復這一離心過程4-5次，最后離心后上清應清亮。棄去上清，此時得到的沉淀為完整沒有破碎的細胞核（沉淀1）。

4.細胞染色質及其相關蛋白的分離

（1）用適量的buffer2溶解細胞核（沉淀1），冰上作用30分鐘，再低速離心（1700g，5分鐘，4℃）進一步獲得沉淀和上清2（核內可溶性組分）。

（2）將步驟4（1）得到的沉淀用buffer2重懸后，離心（1700g，5分鐘，4℃），得到沉淀2（核內不溶性染色質組分）。

5.染色質相關蛋白的檢測

（1）對于獲得的上清1（胞漿和胞膜的混合組分）以及上清2（核內可溶性組分）：需要根據最終獲得的上清體積，加1/3體積的三氯醋酸水溶液（30%）混勻，置于-20℃中過夜。第二天取出，5000g，4℃離心10分鐘，棄去上清。再打開ep管蓋，冰上空氣略干約30分鐘左右，加適量細胞裂解液（1×sdslysisbuffer），4度裂解蛋白。

（2）對獲得的沉淀1（細胞核）以及沉淀2（細胞核內不可溶性的染色質及其相關蛋白組分），直接加入適量的1×sds細胞裂解液，4℃裂解蛋白。

上述組分蛋白裂解后即可加熱變性，測蛋白濃度，進行常規westernblot檢測即可。

6.westernblot實驗

使用上述染色質及其相關蛋白提取方法得到以下各組分，進行蛋白樣本制備，進行westernblot實驗。

另外pmsf儲存濃度為100mm，用前加，添加比例為1:1000。最終定容為10ml。

westernblot實驗過程

（1）選擇sds-page濃縮上膠濃度為5%，分離下膠濃度為8%。

（2）使用恒流進行電泳分離，樣本處于濃縮上膠（一塊膠）時使用20ma，濃縮膠30分鐘左右的時間。樣本開始進入下膠開始分離時，則將電流設置為40ma（相應的電壓應該小于110v）。分離過程需要約1.5小時。

（3）使用濕法轉膜，恒流250ma轉膜3小時。

（4）室溫封閉1小時，一抗采用4度過夜孵育，二抗室溫孵育50分鐘。使用的抗體濃度：

使用胞核表達蛋白histone作為胞核組分的陽性對照，胞漿表達蛋白β-actin作為胞漿組分的陽性對照。

實驗結果表明（參見圖2）：β-actin（胞漿組分的陽性對照）在胞漿和胞膜的混合組分中有表達，在胞核組分（上清1）、核內不可溶性的染色質及其相關蛋白組分（沉淀2）和核內可溶性組分（上清2）中均無表達；histone（染色質的組成蛋白，屬于核內不可溶組分）在胞核組分（上清1）和核內不可溶性的染色質及其相關蛋白組分（沉淀2）中均有表達，而在胞漿和胞膜的混合組分（上清1）和核內可溶性組分（上清2）中無表達。此結果驗證了該方法提取的染色質及其相關蛋白沒有摻雜胞漿、胞膜組分，提取方法有效。