一種腎纖維化miRNA標記物的制作方法

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種腎纖維化mirna標記物及其應用，具體涉及一種與腎纖維化相關的mirna-576標記物及其應用。

背景技術：

mirna是天然存在于體內的21-22nt的非編碼rna分子，是一類通過轉錄后基因沉默對靶基因表達進行調節的rna。據估計，生物體內約有1/3的基因受mirna的調控。mirna與risc的復合體通過堿基配對可與靶基因mrna5’-utr或者3’-utr中的互補序列相結合，抑制蛋白質翻譯，或是引發mrna降解，從而負調控靶基因的表達。

腎纖維化(包括腎間質纖維化和腎小球硬化)是各種原因引起的腎臟損害最后階段的主要病理基礎，腎纖維化發生機制較為復雜，與多種因素有關，其中主要與細胞外基質細胞產生細胞的增殖和活化，血管活性物質、細胞因子以及細胞外基質轉換失衡有關，腎間質纖維化幾乎是所有原發或繼發腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑。

mirna是調節基因表達的內源性非編碼小分子rna，在轉錄后水平對基因表達進行調控，參與細胞周期、凋亡、發育、分化和新陳代謝等生理過程。mirna在細胞中表達失調會導致腎纖維化在內的多種疾病的發生，最新研究表明，一些mirna在腎纖維化患者的腎臟和尿液中異常表達，但何種mirna與腎纖維化的發生、發展有關仍未達成共識。因此有必要尋找與腎纖維化發生、發展有關的mirna，從而為臨床上判斷和治療腎纖維化提供一種有效手段。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種可用于判斷腎纖維化的mirna標記物。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

本發明提供了一種用于預判腎纖維化風險、診斷腎纖維化的mirna標記物，所述mirna標記物是mirna-576。所述mirna-576選自以下組中的至少一種：：mirna-576初始mirna、mirna-576前體mirna、成熟mirna-576；所述mirna-576初始mirna能在人細胞內被剪切并表達成成熟mirna-576；所述mirna-576前體mirna能在人細胞內被剪切并表達成成熟mirna-576。

應當知道，本發明的mirna-576包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其顯示完整mirna-576核酸分子相同的功能，盡管它們通過核苷酸殘基的缺失、置換或者插入而突變。

本領域人員熟知，為了保證mirna的穩定性，可以在mirna的一端或者兩端增加保護性堿基，如tt，也可對mirna堿基進行修飾，但是不影響mirna的功能。因此，本領域技術人員熟知，在不影響mirna-576功能的條件下，對mirna-576進行堿基修飾或者在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發明的保護范圍之內。

在本發明的一些具體的實施方式中，所述mirna-576是成熟mirna-576。所述成熟mirna-576包括mirna-576-5p、mirna-576-3p，它們共同享有共同的種子序列。

雖然在某些具體實施方式中所使用的是成熟mirna-576，但是本領域技術人員可以預期，初始mirna(pi-mirna-576)、前體mirna(pre-mirna-576)將可以獲得與成熟mirna-576同樣的技術效果，因為細胞有能力進一步將初始mirna(pi-mirna-576)、前體mirna(pre-mirna-576)加工為成熟mirna-576。

本發明的mirna-576核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的mirna-576主要呈單鏈形式，而mirna-576前體是部分自互補的，以形成雙鏈結構。本發明的核酸分子可以是rna、dna、pna、lna的形式。

本發明提供了mirna-576在制備預判腎纖維化風險的工具中的應用。

本發明還提供了mirna-576在制備診斷腎纖維化的工具中的應用。

本發明的實驗證明已發生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平顯著低于為未發生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平。因此，與未發生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平相比，如果受試者尿液中mirna-576的水平顯著降低，那么則可以判斷該受試者已發生腎纖維化，從而采取預防腎纖維化的方案或者為臨床治療方案的制定提供診斷基礎。

本發明還提供了mirna-576在判斷腎纖維化的工具中的應用。與不發生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平相比，如果受試者尿液中mirna-576的水平顯著境地，則表明受試者發生腎纖維化。

進一步，上述預判腎纖維化風險、判斷腎纖維化是否發生的工具包括但不限于，芯片、試劑盒。所述工具包括用于待測樣本中mirna-576表達水平的試劑。所述試劑可以是針對mirna-576的引物或探針。

本發明還提供了上述mirna-576在高通量測序平臺中的應用。通過高通量測序能獲知待檢測樣本腎組織或尿液中mirna-576的表達水平，將待測樣本的結果同未發生腎纖維化的腎組織或尿液相比，容易判斷待測樣本是否存在腎纖維化的風險或者容易判斷待測樣本是否已經發生了腎纖維化。因此，經過高通量測序獲得mirna-576與腎纖維化相關性的應用同樣包含在本發明的保護范圍之內。

本發明還提供了一種用于預判腎纖維化風險、診斷腎纖維化是否發生的芯片，所述芯片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應于mirna-576的部分或全部序列。所述寡核苷酸探針還可包括針對現有技術中已經報道的可用于判斷腎纖維化是否發生的mirna的寡核苷酸探針。將多種mirna的檢測探針放置在同一芯片上通過檢測多種mirna指標聯合判斷腎纖維化的情況也包含在本發明的保護范圍之內。

進一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因芯片領域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。

所述的mirna芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片的常規制造方法，例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dt串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發明的mirna芯片。

本發明還提供了一種用于預判腎纖維化風險、診斷腎纖維化是否發生的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測受試者腎組織或尿液中mirna-576的表達水平的試劑。與未發生腎纖維化的腎組織或尿液中的mirna-576的表達水平比較，若通過試劑盒檢測腎組織或尿液中mirna-576的表達水平顯著降低，則判斷該受試者的腎纖維化風險很高或者已發生腎纖維化。

進一步，所述試劑包括針對mirna-576的引物和/或探針。所述試劑還包括針對現有技術中已經報道的可用于判斷腎纖維化風險，或者判斷腎纖維化是否發生的mirna的引物和/或探針。將多種mirna的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種mirna指標聯合判斷腎纖維化的情況也包含在本發明的保護范圍之內。

本發明的mirna-576可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達mirna-576的dna片段的載體轉染細胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。

病毒載體可以是任何適當的載體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及eb病毒)載體、甲病毒載體。

真核表達載體可以是任何適當的表達載體，包括但不限于pcmv-myc表達載體、pcdna3.0表達載體、pcdna3.1表達載體、pegfp表達載體、pefbos表達載體、ptet表達載體、ptre表達載體、或者在公知表達載體的基礎上經改造的載體，比如pbin438、pcambia1301等。

可以表達mirna-576的dna片段可以通過如下方式獲取：從mirna數據庫中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)尋找mirna-576在基因組上的位置及具體序列信息，根據基因組序列確定mirna-576初始mirna的位置，在mirna-576初始mirna位置的上下游500-800bp區間內設計特異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表達mirna-576的dna片段。

本發明還提供了前面所述的mirna-576在制備抑制或治療腎纖維化的藥物中的應用。

本發明的實驗證明mirna-576與腎纖維化相關，在此基礎上，通過促進mirna-576的表達可用于抑制腎纖維化的發生或發展的風險。

進一步，所述藥物包含mirna-576激動劑。所述mirna-576激動劑能夠促進mirna-576的表達或者能夠激活mirna-576的功能。所述mirna-576激動劑的抑制靶標不限于mirna-576本身，還包括mirna-576的上下游，例如：編碼mirna-576的基因組序列，mirna-576靶基因、調控mirna-576的蛋白或者基因。

進一步，mirna-576抑制劑包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。

優選地，所述mirna-576抑制劑是mirna-576的反義寡核苷酸或者mirna-576模擬物。

根據mirna-576序列容易設計出它的反義寡核苷酸，將反義寡核苷酸轉移到人體內后，它們能夠明顯下調mirna-576的表達。“反義寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，as-ons或aso)”又稱為“反義核苷酸”，是指長度約為18-26nt(更特別的約19-22nt)的dna分子或rna分子或其類似物。

在本發明中，所述的“反義寡核苷酸”還包括采用如基于核酸鎖或核酸鏈骨架修飾技術等手段獲得的經修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義寡核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義寡核苷酸的穩定性、活性或治療效果。核酸鎖(lockednucleicacid，lna)通常是指通過一個亞甲基橋將核糖的2’氧原子和4’碳原子連接起來的修飾技術。基于核酸鏈骨架的修飾技術發展出的反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，例如將脫氧核苷酸鏈硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈。該方法是將dna骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。應理解，任何能夠保持所述反義寡核苷酸的大部分或全部活性的修飾都包含在本發明中。

本發明的抑制腎纖維化的藥物還包含藥物學上可以接受的載體，所述載體包括但不限于：稀釋劑、緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮吸收劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。

所述藥物可以制成包括但不限于顯微注射劑、適于轉染的劑型、注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。

所述藥物可以單獨施用；或者與其他能夠抑制腎纖維化的藥物進行組合施用。

所述藥物可以離體施用：將mirna-576或者mirna-576的表達載體在體外導入或轉染人體自身或異體細胞(或異種細胞)，經體外細胞擴增后，輸回人體。

所述藥物可以體內施用：將mirna-576或者mirna-576的表達載體直接導入體內。這種載體可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸dna或rna。

所述的受試者可以是人類或者其他哺乳動物。更具體地，受試者是器官、組織、細胞。

附圖說明

圖1為mirna-576在腎纖維化人群和非纖維化人群的尿液中的表達情況；

圖2為腎小管上皮細胞hk-2在腎纖維化過程中的細胞形態變化情況；

圖3為mirna-576在腎纖維化細胞系中的表達情況；

具體實施方式

下面結合具體的實施例進一步說明本發明，本發明的實施例僅用于解釋本發明，并不意味著限制本發明的保護范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1

本實施例證明mir-576在腎纖維化人群的尿液樣本中低表達。

1.mirna提取

使用tiangen的mirna提取試劑盒，每200μl尿液中加入等體積裂解液，振蕩器振蕩混勻30秒。室溫放置5min后，12,000rpm離心10min，取上清，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置5min后，12,000rpm離心15min，樣品會分成三層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，rna主要在水相中，把水相轉移到新管中，緩慢加入轉移液體積1/3體積的無水乙醇混勻，一起轉入吸附柱，室溫放置2min,12,000rpm離心30秒，保留流出液。緩慢加入流出液體積2/3體積的無水乙醇，混勻，一起轉入吸附柱，室溫放置2min后12,000rpm離心30秒，離心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室溫12,000rpm離心30sec，棄廢液。500μl漂洗液，室溫12,000rpm離心30秒。將吸附柱放入2ml收集管中，室溫12,000rpm離心1min，去除殘余液體。再將吸附柱轉入一個新的1.5ml離心管中，加15-30μl無rna酶的水，室溫12,000rpm離心2min。

2.逆轉錄

將10pg-1μg的rna模板與2μl10倍緩沖液、2μldatp(10mm)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制劑和無核糖核酸酶水混合，體積最后為20μl，37℃孵育1h。然后反應管中加入1μl0.5μg/μl特異性rt引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打斷rna和引物的二級結構。最后，將上述20μl反應混合物與4μl5倍緩沖液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆轉錄酶，0.5μl核糖核酸酶抑制劑，10μlpolya反應混合液和4μl無核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

3.q-pcr檢測

采用25μl反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可靠性。配制以下反應體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl，正向引物(5μm/l)1μl，反向引物(5μm/l)1μl，模板cdna2μl，無酶水8.5μl。各項操作均于冰上進行。擴增程序為：95℃10min,(95℃20s，60℃55s)40個循環。以sybrgreen作為熒光標記物，在熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

4.結果

如圖1所示，在腎纖維化人群尿液中的mirna-576含量顯著低于未發生腎纖維化的人群(*p<0.05)，mirna-576能夠作為檢測腎纖維化的標記物。

實施例2

本實施例證明mirna-576在腎纖維化細胞系中低表達。

1.emt細胞模型

emt是指上皮細胞間充質轉化，是腎纖維化過程的一部分。采用腎小管上皮細胞系hk-2細胞，在hk-2細胞培養液中加入tgf-β至終濃度為10ng/ml，培養48h后拍照觀察：未加入tgf-β的hk-2細胞具有典型的上皮細胞鵝卵石樣形態特征，胞間銜接緊密；加入tgf-β的hk-2顯示出梭形的形態，細胞間間隙明顯，細胞較為瘦縮，類似成纖維細胞的形態，如圖2所示。

2.mirna提取和反轉錄，參考實施例1中的實驗過程。

3.q-pcr檢測，參考實施例1中的實驗過程

4.結果

如圖3所示，在發生腎纖維化的細胞中，mirna-576的含量顯著低于對照細胞系(*p<0.05)，mirna-576是腎纖維化發生過程的標記物。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。

mir-576

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