一種降解除草地膜的菌株GFDZ1及菌劑制備方法和應用與流程

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種可降解除草地膜的菌株gfdz1及菌劑制備方法和應用。

背景技術：

我國20世紀70年代開始使用地膜，目前地膜應用已經覆蓋棉花、玉米、小麥、水稻、蔬菜、花生、甘蔗、煙草等眾多種類作物；地膜已經成為繼化肥、種子和農藥以外的第四大農業生產物質資料。地膜應用于農業生產具有很多積極作用，包括:提高和保持土壤溫度，保持水分、提高水分利用率，增肥保肥、提高土壤肥效，保持土壤疏松，提高光效，抑鹽保苗。因此，地膜在我國大部分省、自治區和直轄市的農業生產中都得到了普遍使用。

地膜的主要生產原料為聚乙烯，它是一種人工合成的高分子化合物，在自然環境中降解速度極慢，可能需要上百年的時間才能完全降解。地膜在我國普遍使用，殘留的地膜集中在我國各區域的部分農田中，分布區域非常廣泛，這給殘留地膜的回收帶來了很大的困難，我國地膜的回收率不足三分之一。隨著地膜每年的使用，殘留在土壤中的地膜越來越多，造成的環境污染問題已日益突出。鑒于聚乙烯的難降解性，目前人們不斷研究開發新型地膜，光降解地膜，生物降解地膜，光-生物雙降解地膜，含除草劑光降解地膜等。

含除草劑光降解地膜不僅具備了增肥、保肥、保水的作用，還可以有效抑制雜草生長，同時可以被光分解。但是這種光降解地膜的降解速率受光照強度影響較大，而且它并不能完全降解，只是能分解成大小不同的碎片，這種碎片進入土壤中仍會長期殘留，影響作物根系生長和對土壤養分的吸收。同時，由于該地膜中含有除草劑的成分，對普通的微生物具有一定抑制作用，使這些碎片更加難以降解。

技術實現要素：

為了解決上述問題，針對目前含除草劑光降解地膜降解不徹底，生物降解性差的問題，本發明提供了一種可降解除草地膜的菌株gfdz1及菌劑制備方法和應用。

本發明的目的在于提供一株淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1。

本發明的另一個目的在于提供上述菌株在降解除草地膜中的應用。

本發明的再一個目的在于提供一種含有淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1的制劑。

本發明的再一個目的在于提供淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1菌劑的制備方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種可降解除草地膜的菌株gfdz1，經鑒定為淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)，2016年12月12日保藏于廣東省農業微生物菌種保藏中心，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所，保藏編號為gdmccno.60131，建議的分類命名為paecilomyceslilacinusgfdz1，已于2016年12月16日鑒定保藏的菌株是存活的。

本發明的有益效果是：

1)本發明獲得的菌株對除草劑有耐受性，能夠在除草地膜上快速生長。

2)本發明所獲得的菌株不僅可以在除草地膜上生長，還可以以其作為生長所需的碳源，將除草地膜進行快速降解。

3)本發明所制備的菌劑，方法簡單，該菌劑為微生物發酵產品，無毒害，無環境污染，在農田中應用降解地膜的同時不會造成二次污染。

4)本發明所制備的菌劑培養基配方價格低廉，易獲取。本發明固體發酵培養基培養基中加入了有利于淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1菌體的快速生長和孢子的形成，提高孢子產量。

附圖說明

圖1為淡紫擬青霉gfdz1降解除草地膜7天后的效果；a為7天后對照組和實驗組中除草地膜的降解情況，b為將淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1接種到含除草地膜的無機鹽培養基中；

圖2為淡紫擬青霉gfdz1降解除草地膜電鏡圖；

圖3淡紫擬青霉gfdz1的平板培養及其在電鏡、顯微鏡下的形態圖。

具體實施方式

淡紫擬青霉，其分類命名為(paecilomyceslilacinus)gfdz1，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心gdmcc，保藏編號為gdmccno：60131。

上述淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1在降解除草地膜中的應用。

優選的，所述除草地膜中含有除草劑，所述除草劑選自甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、異丙甲草胺、敵稗、異丙草胺、異丙隆、莠去津、撲草凈、莠滅凈、嗪草酮和環嗪酮中的至少一種。

一種降解除草地膜的菌劑，該菌劑含有上述所述淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1。

一種用于淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1的固體發酵培養基，該發酵培養基含有0.1％～0.2％的麥芽糖、0.05％～0.1％的硫酸銨、0.02～0.04％的蛋殼粉、0.01％～0.03％的硫酸錳、40％～50％的水，余量為麥麩和玉米粉，其中麥麩和玉米粉的重量比為(4.5～5.2)：(0.8～1.5)。

優選的，上述發酵培養基含有0.12％～0.18％麥芽糖，0.08％～0.1％硫酸銨，0.025～0.035％蛋殼粉和0.015％～0.025％硫酸錳，含42％～58％的水，余量為麥麩和玉米粉，其中麥麩和玉米粉的重量比為(4.8～5)：(1.0～1.2)。

一種制備淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1的菌劑方法，將上述所述的淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1接種于pda平板培養基，在26～30℃條件下活化，將活化后的淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1接種于czapek培養液，26～30℃，110～130r/min條件下培養5～7d，獲得種子液；將種子液按3～5％的接種量接種于上述所述固體發酵培養基，26～30℃潛盤培養6～9d，粉碎后獲得淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1菌劑。

上述所述方法制備的淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1菌劑。

上述所述淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1菌劑在降解除草地膜中的應用。

優選的，所述除草地膜中含有除草劑，所述除草劑選自甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、異丙甲草胺、敵稗、異丙草胺、異丙隆、莠去津、撲草凈、莠滅凈、嗪草酮和環嗪酮中的至少一種。

下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。

實施例1淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1的富集、分離、篩選和鑒定

一種可降解除草地膜的菌株gfdz1，命名為paecilomyceslilacinusgfdz1，由廣東省農業科學院農業資源與環境研究所在田間土壤分離得到。其具體分離、篩選、鑒定方法如下：

(1)除草地膜降解菌株gfdz1的富集

從田間收集已經發生降解的除草地膜。將其放入無機鹽培養(1l)：k2hpo40.7g,kh2po40.7g,mgso4.7h2o0.7g,nh4no31.0g,nacl0.005g,feso4.7h2o0.002g,znso4.7h2o0.002g,mnso4.h2o0.001g，150r/min，30℃培養15d，進行除草地膜降解菌的富集。

(2)除草地膜降解菌株gfdz1的分離

將除草地膜剪成5cm×2cm大小，用70％的酒精消毒，然后在紫外燈下照射4h，貼于固體無機鹽培養基上。吸取0.1ml富集培養的液體涂布于固體無機鹽培養基，30℃培養5d。挑取在除草地膜與培養基交界處的菌株，在培養基上劃線獲得單菌落(細菌用lb培養基，真菌用pda培養基，放線菌用高氏一號培養基)，4℃保存備用。

(3)除草地膜菌株gfdz1的篩選

將上述分離的菌株接種到含有5cm×2cm大小除草劑地膜的液體無機鹽培養基中，150r/min，30℃培養，觀察地膜降解情況，篩選獲得一株真菌能夠快速降解除草地膜。

(4)菌株鑒定

a.形態學觀察：將菌株在pda上培養，觀察菌落形態。本發明菌株在pda固體培養基上菌落較大、成圓形，培養2天時長出白色菌絲體，繼續培養出現淡紫色孢子。經電鏡觀察，分生孢子梗末端膨大。分生孢子為單細胞，呈鏈狀平滑、無色至黃色，孢梗上具有瓶頸狀不規則的分枝或輪生分枝，瓶梗基部較寬(如圖3所示)。

b.分子生物學鑒定：提取真菌基因組總dna，pcr引物為its1：5’-tccgtaggaacctgcgc-3’(seqidno：1)，its2：5’-gctgcgttcttcacgatgc-3’(seqidno：2)。pcr反應體系為50μl，反應條件為：94℃5min，(94℃30s，57℃50s，72℃50s)循環30次；72℃10min。pcr擴增產物測序后將獲得的dna序列輸入genbank，用blast程序與數據庫中的所有序列進行比較，用mega進行系統發育樹的構建。發現本發明菌株與登陸號為gu980033.1的paecilomyceslilacinusstrainnrrl22958菌株同源性達98％，說明本發明菌株為淡紫擬青霉。

實施例2淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1菌劑的制備方法

將上述篩選所得的淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1接種于pda平板，在28℃條件下活化，將活化后的淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1接種于czapek培養液，28℃，120r/min條件下培養5～7d，獲得種子液；將種子液按4％的接種量接種于固體發酵培養基，28℃潛盤培養7d，粉碎后獲得淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1菌劑。

上述固體發酵培養基中含有0.15％麥芽糖，0.08％硫酸銨，0.03％蛋殼粉，0.02％硫酸錳，含水率為45％，余量為麥麩和玉米粉，其中麥麩和玉米粉的重量比為5：1。

所述固體發酵培養基培養基中加入了有利于淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1菌體的快速生長和孢子的形成，提高孢子產量。

實施例3淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1菌劑的制備方法

將上述篩選所得的淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1接種于pda平板培養基，在30℃條件下活化，將活化后的淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1接種于czapek培養液，30℃，110r/min條件下培養7d，獲得種子液；將種子液按5％的接種量接種于固體發酵培養基，30℃潛盤培養6d，粉碎后獲得淡紫擬青霉paecilomyceslilacinusgfdz1菌劑。

所述固體發酵培養基含有0.1％％的麥芽糖，0.05％％的硫酸銨，0.04％的蛋殼粉，0.03％的硫酸錳，含水率為48％，余量為麥麩和玉米粉，其中麥麩和玉米粉的重量比為4.5：1.5。

實施例4淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1對除草地膜的降解能力測定

將淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1接種到含除草地膜(見cn103497412a)的無機鹽培養基中(見圖1b)，觀察地膜變化，并在第7、14、21和30天測定地膜失重率。同時在第7天觀察其電鏡下變化。并設置3個平行及空白對照。

表1除草地膜失重率測定

由表1數據可知接種了淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1的除草地膜的重量在0-30d中不斷下降，至第30d，失重率達到68.10％，說明該菌株對除草地膜具有較好的降解能力。

圖1為經本發明淡紫擬青霉降解除草地膜7天后的效果圖，圖中對照組為菌株降解前的除草地膜，從圖中可以看出，7天后已經可以明顯看出除草地膜發生了降解(圖1a)。說明本發明菌株gfdz1對除草地膜具有很好的降解效果。本發明所獲得的菌株不僅可以在除草地膜上生長，還可以以其作為生長所需的碳源，將除草地膜進行快速降解。本發明所制備的菌劑，方法簡單，該菌劑為微生物發酵產品，無毒害，無環境污染，在農田中應用降解地膜的同時不會造成二次污染。

圖2為淡紫擬青霉gfdz1對除草地膜降解7天后的電鏡圖，從中可以從圖2(左)看到未接種淡紫擬青霉gfdz1的除草地膜在電鏡下未觀察到裂痕，而從圖2(右)看到經淡紫擬青霉gfdz1降解的除草地膜，出現了明顯裂痕，并且淡紫擬青霉菌絲布滿了地膜的表面。

淡紫擬青霉gfdz1平板培養中菌落形態圖如圖3(左)所示，菌落較大、成圓形，有白色菌絲體，表面層淡紫色。圖3(中)為淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1在降解除草地膜過程中的電鏡圖，從中可以看出，其與正常培養時的菌體形相同，生長良好，說明淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1可以附著在除草地膜上很好地生長，并將其降解。圖3(右)為顯微鏡下淡紫擬青霉(paecilomyceslilacinus)gfdz1菌體形態。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

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<110>廣東省農業科學院農業資源與環境研究所

<120>一種降解除草地膜的菌株gfdz1及菌劑制備方法和應用

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