雙酚類化合物及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用與流程

本發明涉及海洋放線菌培養制備化合物
技術領域：
，具體涉及一種雙酚類化合物及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：雄激素和雌激素與受體相結合在人體內發揮著重要生理作用，當人體內雄/雌激素分泌過多時，會影響正常的生理機能并誘發癌癥等疾病，因此研究雄/雌激素受體(ar/er)的作用機制意義重大，而芳香化酶是細胞色素p450酶系中的一種，廣泛存在于卵巢、肝臟、肌肉、脂肪和腫瘤組織中，可以催化雄烯二酮、睪酮脫去19位的碳并使a環芳香化，分別形成雌二醇和雌酮，作為雌激素生物合成的限速酶，對雄/雌激素受體的具有關鍵的調節作用。研究證明芳香化酶與多種常見的女性疾病的病理過程有著密切的聯系，如：乳腺癌、子宮內膜癌、子宮內膜異位癥、卵巢癌、平滑肌瘤等以及男性疾病，如：雄激素依賴性、敏感性前列腺癌。因此芳香化酶可作為一個極好的藥物作用靶標，高選擇性的芳香化酶抑制劑(ais)可以在提高療效的同時又減少不良反應，還能增加患者的耐受性。同時雄/雌激素受體在細胞組織中具有獨特的功能結構域，包括羧基末端配體結合域(lbd)、包含鋅指基序的dna結合域(dad)、n末端結合域(ntd)包含1個或多個轉錄激活中心。ar/er可以在激素產生時不同功能性激活人體的生理機能作用，但是在癌癥細胞組織內沒有激素時通過改變轉導途徑被激活，研究發現癌癥細胞中存在激活的ar/er，因此發現選擇性優良的受體抑制劑，可用于治療與雄/雌激素受體相關的各種癌癥類型。有研究表明，雙酚a類化合物對于ar/er具有較好的生物活性，對于開發應用于相關腫瘤治療具有重大意義。海洋放線菌代謝產物豐富，結構多樣化，活性新穎，易于培養，對于發現具有腫瘤活性的先導化合物具有較大開發空間，從而擴大天然來源的bpa類化合物作為前列腺癌、乳腺癌等治療藥物開發的應用前景。技術實現要素：本發明提供了一種雙酚類化合物及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用，本發明采用大米固體培養基發酵培養海洋放線菌，最終由發酵產物分離純化獲得式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ結構的化合物。一種雙酚類化合物，為式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ結構；所述的雙酚類化合物的制備方法，由海洋放線菌固體發酵產生，經分離純化得到，易于操作和實施。所述的雙酚類化合物的制備方法，包括以下步驟：1)將海洋放線菌接種于高氏一號液體培養基中，搖床培養，獲得種子液；2)將上述所得的種子液接種于大米固體培養基中，靜置培養，萃取獲得發酵產物；3)將上述所得的發酵產物進行分離純化后，獲得式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ結構的化合物。步驟1)中，所述的海洋放線菌，具體可采用市售產品，如采用中國工業微生物菌種保藏管理中心出售的鏈霉菌streptomycessp.cicc11027，訂購網址：http://www.china-cicc.org/。所述的搖床培養的條件為：在26℃～30℃、130rpm～230rpm的搖床中培養2～4天，進一步優選，在28℃、180rpm的搖床中培養3天。步驟2)中，所述的大米固體培養基，由大米和海水組成，所述的大米的質量和海水的體積之比為30g～50g：50ml～70ml，進一步優選，所述的大米的質量和海水的體積之比為40g：60ml，即按大米質量40g和海水體積60ml配比后經高壓濕熱滅菌所得。所述的靜置培養的條件為：在23℃～33℃下靜置培養100～140天，進一步優選，在28℃下靜置培養120天。步驟3)中，所述的分離純化包括：由乙酸乙酯等體積浸泡萃取獲得的發酵產物，經凝膠柱色譜、制備液相色譜獲得式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ結構的化合物。所述的凝膠柱色譜的條件：采用的填料為羥丙基葡聚糖凝膠(lh-20)，采用的洗脫劑為甲醇-水溶液，進一步優選，采用的洗脫劑為甲醇體積數20％-100％的甲醇-水溶液；所述的制備液相色譜的條件：采用的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，采用的流動相為甲醇-水的溶液、含三氟乙酸的甲醇溶液-水的體系，進一步優選，采用的流動相為體積百分數40％-100％甲醇-水的溶液；體積比百分數40％至100％的含三氟乙酸的甲醇溶液-水的體系，即含三氟乙酸的甲醇溶液與水的體積比為40：60至100：0，所述的含三氟乙酸的甲醇溶液為含體積百分數0.05％三氟乙酸的甲醇溶液。本發明采用人前列腺癌細胞株pc3進行活性評價試驗，本發明提供的化合物式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ能抑制pc3的生長，充分說明該類化合物具有受體抑制活性從而發揮細胞毒性作用，因此可制備獲得作為抗腫瘤藥物。所述的式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ結構的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，可單一成分或多成分組合可用于治療與雄/雌激素受體(ar/er)和芳香化酶有關的乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等癌癥，以及艾滋病，痤瘡、頭發脫落、多囊卵巢等疾病的藥物。與現有技術相比，本發明具有如下優點：本發明中具有抗腫瘤活性的化合物，可用于開發治療雄/雌激素受體、芳香化酶相關的癌癥藥物；所述的式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ結構的化合物可用于研究微生物代謝通路中對有細胞毒性化合物的生合成途徑；本發明實驗操作簡單，易于擴大生產，具有較好的應用前景。附圖說明圖1為式ⅰ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-30f的1h-nmr圖譜；圖2為式ⅰ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-30f的13c-nmr圖譜；圖3為式ⅰ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-30f的hsqc圖譜；圖4為式ⅰ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-30f的hmbc圖譜；圖5為式ⅰ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-30f的1h-1hcosy圖譜；圖6為式ii結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31h的1h-nmr圖譜；圖7為式ii結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31h的13c-nmr圖譜；圖8為式ii結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31h的hsqc圖譜；圖9為式ii結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31h的hmbc圖譜；圖10為式ii結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31h的1h-1hcosy圖譜；圖11為式ⅲ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31i的1h-nmr圖譜；圖12為式ⅲ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31i的13c-nmr圖譜；圖13為式ⅲ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31i的hsqc圖譜；圖14為式ⅲ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31i的hmbc圖譜；圖15為式ⅲ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31i的1h-1hcosy圖譜；圖16為式ⅳ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31f的1h-nmr圖譜；圖17為式ⅳ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31f的13c-nmr圖譜；圖18為式ⅳ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31f的hsqc圖譜；圖19為式ⅳ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31f的hmbc圖譜；圖20為式ⅳ結構中抗腫瘤活性的化合物a68-31f的1h-1hcosy圖譜。具體實施方式實施例1一、化合物的發酵海洋放線菌采用中國普通微生物菌種保藏管理中心出售的鏈霉菌streptomycessp.cicc11027；1)將海洋放線菌接種于500ml錐形瓶中，每瓶含250ml高氏一號液體培養基，培養條件為28℃、180rpm的搖床中恒溫培養3天，獲得種子液；2)將步驟1)所得的種子液接種至大米培養基(大米培養基，由以下組分制成：大米質量40g；海水60ml，置于500ml錐形瓶后經高壓濕熱滅菌所得)，接種體積為12ml，在28℃下靜置培養120天，得到含有本發明具有抗腫瘤活性的化合物的固體發酵產物。二、化合物的制備將含有本發明具有抗腫瘤活性的化合物的固體發酵產物用乙酸乙酯萃取3次，溶劑回收濃縮，獲得粗體物。將所得粗體物進行凝膠柱色譜(填料為羥丙基葡聚糖凝膠lh-20)，洗脫劑為甲醇體積百分數20％-100％的甲醇-水體系梯度洗脫，每1/4柱體積為一個餾分，tlc分析合并含有目標化合物的餾分。對目標組分采用中壓制備色譜分離(sepaxamethystc-18(10μm,30×400mm)色譜柱，檢測波長210nm)，流動相為甲醇體積百分數40％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，tlc分析合并含有新化合物的餾分，得到含有新化合物的組分。所得含有新化合物的組分采用高效制備液相色譜分離(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色譜柱，檢測波長210nm，填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠)，采用的流動相為體積百分數60％-100％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa，即含體積百分數0.05％三氟乙酸的甲醇溶液)/水體系以10ml/min等度洗脫，收集63-64min的色譜峰，回收溶劑，得到化合物a68-30f，如圖1至5所示，依據核磁共振數據，其結構如下所示，為式i結構。分子式根據高分辨質譜hr-esi-ms計算為c35h39n2o8([m+h]+615.2692,calculated615.2701)，鑒定化合物為(9r/22r)-bisphenolabis(9(22)-hydroxy-10(23)-anthranilicacid-propyl)ether，簡稱為a68-30f，具體結構如下：所得含有新化合物的組分采用高效制備液相色譜分離(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色譜柱，檢測波長210nm)，采用的流動相為體積百分數78％-83％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa)/水體系以10ml/min等度洗脫，收集22-25min的色譜峰，回收溶劑，得到化合物a68-31f。如圖6至10所示，依據核磁共振數據，其結構如下所示，為式ⅱ結構。分子式根據高分辨質譜hr-esi-ms計算為c29h36no7([m+h]+510.2480,calculated510.2486)，鑒定化合物為(9r/22r)-bisphenola(9-hydroxy-10-anthranilicacid-propyl)(22-hydroxy-23-methoxy-propyl)ether，簡稱為a68-31h，具體結構如下：所得含有新化合物的組分采用高效制備液相色譜分離(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色譜柱，檢測波長210nm)，采用的流動相為體積百分數80％-85％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa)/水體系以10ml/min梯度洗脫，收集17-19min色譜峰，回收溶劑，得到化合物a68-31i。如圖11至15所示，依據核磁共振數據，其結構如下所示，為式ⅲ結構。分子式根據高分辨質譜hr-esi-ms計算為c28h34no7([m+h]+496.2364,calculated496.2330)，鑒定化合物為(9r/22r)-bisphenola(9-hydroxyl-10-anthranilicacid-propyl)(22,23-dihydroxyl-propyl)ether，簡稱為a68-31i，具體結構如下：所得含有新化合物的組分采用高效制備液相色譜分離(agilentpursuitc-18(10μm,21.2×250mm)色譜柱，檢測波長210nm)，采用的流動相為78％-83％含三氟乙酸的甲醇溶液(0.05％tfa)/水體系以10ml/min梯度洗脫，收集16-17min色譜峰，回收溶劑，得到化合物a68-31f。如圖16至20所示，依據核磁共振數據，其結構如下所示，為式ⅳ結構。分子式根據高分辨質譜hr-esi-ms為c25h28no5([m+h]+422.1975,calculated422.1963)，鑒定化合物為(9r)-bisphenola(9-hydroxy-10-anthranilicacid-propyl)ether，簡稱為a68-31f，具體結構如下：化合物的核磁鑒定(1h500mhz,13c125.7mhz)，其結果如表1和表2所示。表1表2三、抗腫瘤活性實驗采用磺酰羅丹明b(sulforhodamineb，srb)比色法檢測化合物對人前列腺癌細胞株pc3細胞的增殖抑制作用。取對數生長期的細胞，配置成5×104個/ml，以100μl/孔鋪于96孔培養板，co2培養箱中培養24小時，取出培養板后于每孔中加入不同濃度的待測樣品，每個濃度設3個復孔，加藥完成后，置于co2培養箱中繼續培養72小時后取出培養板，棄去培養液，每孔加入100μl4℃冰箱預冷的質量百分數10％的三氯醋酸(tca)固定，靜置5分鐘后，再將培養板移至4℃冰箱過夜。倒掉固定液，每孔用去離子水洗滌5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入70μlsrb溶液，室溫25℃放置20分鐘，去上清液，用質量百分數1％醋酸洗滌5次，空氣干燥。結合的srb用100μl/孔10mmol/ltris堿液(ph＝10.5)振蕩溶解。置于酶標儀中測定各孔光吸收，測定波長為515nm。根據各孔od值計算藥物對細胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(od515給藥孔/od515對照孔)]×100％，根據各濃度抑制率可計算半數抑制濃度ic50。10μg/ml濃度抑制率，其結果如表3所示表3化合物10μg/ml濃度抑制率a68-30f37.46％a68-31h20.08％a68-31i38.22％a68-31f36.98％從上述結果可以看出，本發明提供的化合物式i、式ii、式ⅲ、式ⅳ能抑制pc3的生長，充分說明該類化合物具有受體抑制活性從而發揮細胞毒性作用，因此可制備獲得作為抗腫瘤藥物。當前第1頁12