辣椒堿類化合物、其提取方法及其應用與流程

本發明涉及用于核酸染色的新穎的辣椒堿類化合物、其提取方法及其應用。

背景技術：

目前在分子生物學核酸電泳中主要是使用溴化乙啶(ethidiumbromide，eb)作為染色液進行染色。溴化乙啶來自化學合成，是最常用的嵌入性熒光染料。活細胞或固定細胞均能從極稀溶液中攝取eb染料，dna螺旋暫時彎曲允許eb熒光染料嵌入大分子疏水中心的堿基對之間。

已有國內外的生物公司生產大分子量核酸染料用于替代溴化乙錠(eb)，但是其市場價格極其昂貴，且采用化學合成，工藝復雜，成本高。

目前市場還沒有植物提取物當作分子生物學核酸染料。

目前市場上已知的各種食用色素都具有較強的染色力，如辣椒紅色素、番茄紅色素、胡蘿卜色素、姜黃素等等，但作為核酸染色劑的用途未見報道。

辣椒(又名：番椒、海椒、辣子、辣角、秦椒等，拉丁文名：capsicumannuuml.)，是一種茄科辣椒屬植物，為一年或有限多年生草本植物。果實通常成圓錐形或長圓形，未成熟時呈綠色，成熟后變成鮮紅色、黃色或紫色，以紅色最為常見。辣椒的果實因果皮含有辣椒素而有辣味。辣椒的成分相當復雜，但主要成分是辣椒堿和辣椒色素，以及具有特有香味的揮發物。通過將辣椒素與蛋白質、碳水化合物、脂肪、無機鹽分離開來，獲得一種濃縮物，其中辣椒堿可溶于乙醇、乙醚、苯及堿性水溶液中。辣椒中揮發物用水蒸餾與溶劑萃取收集后，在色質聯用儀中進行分析，證明有醇、羥基化合物，吡嗪環狀碳水化合物、樹脂類等各種成分。

由于辣椒中辣椒堿和辣椒色素混合物中單成分極性非常接近，對分離技術提出很高的要求，因而迄今為止未見報道用于核酸染色的辣椒的單成分化合物。

技術實現要素：

本發明提供一種從辣椒提取的天然產物，其是一種優質天然色素，用于核酸dna的染色。

因此，本發明的一個目的在于提供式i的化合物：

本發明還提供一種制備所述的式i化合物的方法。

本發明所述的制備所述的式i化合物的方法包括以下步驟：

(1)提取：以干燥辣椒粉為原料，以乙醇作為浸取劑，室溫靜止浸取，得到浸取液；

(2)濃縮：在低于80℃的溫度(或優選35-78℃)減壓蒸發除去乙醇，得到濃縮物；

(3)萃取提純：濃縮物溶于水中，過濾，除去濃縮物中的膠狀的樹脂類雜質，棄掉濾餅，用氯仿萃取濾液，然后蒸發除去萃取溶劑，得到較純的提取物辣椒堿混合物；

(4)柱層析分離：采用柱層析法對步驟(3)所得的辣椒堿混合物進行分離，采用的洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑，收集含所述的式i化合物的洗脫液，濃縮后分離得到所述的式i化合物。

在一實施方式中，所述步驟(1)具體為：采用95％乙醇室溫靜止浸取干燥辣椒粉24-48小時，優選24小時，較優選36小時，更優選48小時。在一實施方式中，所述步驟(1)具體為：采用95％乙醇室溫靜止浸取干燥辣椒粉24-48小時。

在一實施方式中，所述步驟(2)中，在35-78℃減壓蒸發乙醇。在一實施方式中，可以先在較低溫度，例如在35℃-45℃，優選35℃(或36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃或45℃)減壓蒸發一部分乙醇，然后升溫至60℃-78℃(60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃，71℃，72℃，73℃，74℃，75℃，76℃，77℃，78℃，或79℃)減壓蒸發殘余乙醇。

在一實施方式中，所述步驟(3)中采用氯仿萃取濾液1-4次，或1-3次。

在一實施方式中，所述步驟(3)中濃縮物與水的重量比例為1:40-100，優選1：50-90，較優選1:50-80，最優選1:50。

在一實施方式中，所述步驟(4)中，以體積比為10：1的石油醚和乙酸乙酯洗脫劑混合物進行洗脫。

在一實施方式中，本發明所述的制備所述的式i化合物的方法包括以下工藝流程：

辣椒→干燥→粉碎→乙醇→浸取→濃縮→氯仿→提純→辣椒堿類化合物。

在一實施方式中，本發明所述的制備所述的式i化合物的方法可以具體如下：

1、原料的準備：選用色紅、味辣、水分低、無霉變的干辣椒加工成辣椒粉。或者選用市售的無霉變的干燥辣椒粉作為原料。

2、提取(或浸取)：采用常溫靜止浸取的方法進行提取。選用95％無毒、價廉、易得的食用酒精作為浸取劑，常溫靜止浸取24-48小時。

3、濃縮：將浸取液在35-78℃減壓蒸發除去乙醇，得到濃縮物。具體為：將浸取液送入旋蒸裝置內，減壓蒸發除去乙醇，接收乙醇可循環利用。隨著乙醇的蒸發，浸取液的濃度不斷升高，顏色變深。蒸餾后期，要控制加熱溫度，溫度不能超過80℃，防止焦化。所得濃縮物冷卻至室溫后，是一種濃稠的暗紅色液體。

4、萃取提純：濃縮物溶于水中，為了除去濃縮液中的雜質，過濾，去掉膠狀的樹脂類物質，還需要進一步用氯仿萃取1-3次，合并萃取液，硫酸鎂干燥24小時，再將提純溶液減壓濃縮，得到較純的提取物辣椒堿類混合物。

5、柱層析分離：采用柱層析法分離，使用石油醚：乙酸乙酯體積比為10:1的混合物洗脫，收集各成分溶液，減壓旋蒸得到純的單體化合物，進行結構鑒定，得到本發明所述的式i化合物。

產品性質：用本發明所述方法制得的式i的辣椒堿類化合物在常溫下是一種暗紅色的固體，熔點為215-220℃，易溶于各種有機溶劑和水。

本發明還涉及所述的式i化合物用于核酸染色的用途。

在一實施方式中，所述核酸為脫氧核糖核酸。

本發明還涉及一種核酸染料，其是本發明所述的式i化合物。

本發明還涉及一種試劑盒，其包含作為核酸染料的式i化合物。

本發明所述的式i化合物具有以下有益效果：1、染色力強，染色效果好；2、相比于溴化乙啶，環境友好；3、用量非常非常少，即可獲得良好的染色效果；4、原材料易于獲得，成本更低；5、容易保存，無需避光。

本發明所述的方法原料易得，工藝簡單，成本低。

本發明所述的提取步驟采用的常溫靜止浸取的方法具有設備簡單、操作方便、節省能源等優點，有利于廣泛應用。

附圖說明

圖1為使用本發明實施例1的式i化合物染色的dna電泳圖。

具體實施方式

下面將結合實施例進一步說明本發明的實質內容和有益效果，該實施例僅用于說明本發明，而非對本發明進行限制。

實施例1式i化合物的提取分離與表征

1.儀器與材料

在以下實施例中使用的試劑均為市售常規試劑，除非另有明確指明。柱層析法采用的試劑為化學純。

儀器：旋轉蒸發儀(鞏義市予華儀器有限公司)；柱層析用硅膠柱子(北京欣維爾玻璃儀器有限公司)；柱層析硅膠(乳山市太陽干燥劑有限公司；硅膠目數為200-300目；核磁共振儀(美國anasazi公司)；質譜儀(waters公司)；紅外光譜儀(德國布魯克公司)；熔點儀(梅特勒-托利多公司)。

2.式i化合物的提取分離

取5公斤干辣椒(市售)，粉碎成粉末。投入于10升的玻璃容器中，并加入5升95％乙醇，室溫靜浸24-48小時。過濾，收集乙醇溶液，用旋轉蒸發儀在低于80℃減壓旋蒸，得到45.12克混合物。混合物溶于2256克水中，過濾去掉雜質。用氯仿萃取濾液3次，合并有機相，干燥，濃縮除去溶劑。得到31.3克樣品。

使用200毫升的硅膠柱子，填充100克柱層析硅膠。濃縮得到的樣品31.3克用100ml乙醇溶解后，與50克硅膠混合并旋干，使用石油醚濕法上樣。洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝10:1，使用該洗脫劑洗脫，收集含式i化合物的洗脫液并濃縮。分離得到的式i化合物性狀為暗紅色固體，化合物重量為5.65克。

3.式i化合物結構表征

式i化合物辣椒堿：暗紅色固體，[α]²⁰d+22.5(c0.2,chcl3)；由電噴霧離子質譜信號m/z:639.2059[m+h]⁺，推算其分子式為c29h26n3o6i；紫外光譜在245nm和302nm有強吸收，說明該化合物具有二氫啡啶環結構特征；紅外光譜在2978cm^-1、1376cm^-1、1282cm^-1、1296cm^-1處有吸收峰，提示該化合物含有苯酚羥基、羰基和苯胺基。¹h核磁共振譜顯示啡啶環上的六個芳香氫質子信號[δ7.67(1h,d,j＝7.54hz),7.13(1h,m),7.11(1h,m)，7.12(1h,d,j＝7.6hz)，6.55(1h,s),6.12(1h,s)]和兩個二氫啡啶環上的特征氫質子信號[δ4.63(1h,dd,j＝9.6hz)和4.42(1h,d,j＝9.6hz)]，以上核磁數據提示該化合物為式i的辣椒堿。從hmbc譜中可以看到h-3′a(δ3.36)/h-5′b(δ2.41)/h-14′(δ1.49)和c-18(δ173.0)具有相關，說明c-16和c-17以亞甲基方式連接，¹h和¹³c核磁共振數據見表1。從上述表征可以確定化合物辣椒堿的化學結構式。

表1式i的辣椒堿的核磁共振數據

實施例2

dna染色實驗

1.試劑及儀器：

tbe緩沖液(tris-硼酸；中科瑞泰(北京)生物技術有限公司)；瓊脂糖(北京沃比森科技有限公司)；微量移液槍(美國賽默飛公司)；凝膠成像儀(美國biorad公司)

2.溶液配制：

2.1取20ml5×tbe緩沖液，加水至200ml，配制成0.5×tbe稀釋緩沖液，待用。

2.2取2毫克實施例1得到的式i辣椒堿，用1毫升水溶解，制成濃度為2mg/ml的水溶液。

3.實驗方法

制備膠液：稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml0.5×tbe稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，得到0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。

灌膠：將有機托盤放入制膠模具上，插上1*3mm九齒梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入如上配制的本發明辣椒提取物的水溶液5μl，搖勻。將瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，為50℃，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠。然后向槽內加入0.5×tbe稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。

加樣：取d2000dnaladder(北京天根生化科技有限公司)和100bpdnaladder(北京天根生化科技有限公司)，用微量移液槍在第二、四泳道里分別加入2.5ul和5ul的d2000dnaladder，在第六、八泳道里分別加入2.5ul和5ul的100bpdnaladder。

電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在80v，電流在40ma以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。

染色：膠板在電泳前已經在灌膠步驟用本發明實施例1的式i化合物預染。

觀察和拍照：在波長為254nm的紫外分析儀下觀察染色后的電泳膠板。凝膠顯示出清晰可辨的桔紅色熒光條帶。染色圖片如圖1所示，圖1中從左邊起分別為第二、第四、第六和第八泳道。

圖1表明，本發明實施例1的式i化合物染色用量非常非常少，即可獲得良好的染色效果。

本發明不受上面所顯示和描述的實施例的限制，而是在權利要求的范圍內可以改變。