一種細胞周期阻滯劑6BAR在人肺癌細胞中的應用的制作方法

本發明涉及細胞分裂素n6-benzyladenosine(6bar)作為一種細胞周期阻滯劑對肺癌細胞株抗腫瘤作用，屬于生物化學與分子生物學技術領域。

背景技術：

肺癌目前是全球范圍內發病率及死亡率最高的惡性腫瘤。近20年來，由于大力推行戒煙，歐洲和美國等西方國家男性肺癌的發病率已開始下降，但女性肺癌的發病率卻持續上升。我國是香煙生產和銷售大國，不論男性還是女性，肺癌的發病率均呈持續上升趨勢，尤以女性發病率上升更快。臨床研究表明，原位癌治愈率接近100％，i期肺癌患者的5年生存率達60％～90％，而ⅲb和ⅳ患者的5年生存率僅5％～20％。臨床上用于治療肺癌的常規藥物雖然對治療起到重要作用，但卻存在著明顯的毒副作用。經大量實踐證明，運用現代技術，從天然產物中獲得的天然活性物質的活性成分能治療肺癌，同時減輕放化療的毒副作用。因此，尋找有效提高治療效率，毒副作用小的天然藥物來治療肺癌是十分必要的。

細胞分裂素ck(cytokinin)是二十世紀五十年代年被發現的一類植物激素，它在植物的生長發育中起決定性作用，天然存在的細胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，是其嘌呤n6位置上的h被其它基團取代形成的。常見的天然存在的細胞分裂素有：玉米素(zeatin,zt)、玉米素核苷(zeatinriboside,zr)、二氫玉米素(dihydrozeatin,dhzt)、異戊烯基腺苷(isopentenyladenosine,i6a)。目前越來越多的研究發現，ck不僅調節植物的生長發育同時對動物細胞的增值和分化也起到很重要的影響。

n6-benzyladenosine(6bar)是存在于植物中的細胞分裂素(ck)的一種核苷形式，俗名為6-芐基腺苷，分子式為c17h19n5o4,分子量為357.36。核苷類似物是一類重要的抗癌化療劑，包括各種嘌呤和嘧啶核苷的衍生物，核苷類似物家族主要是一類抗代謝物，通過干擾腫瘤細胞的dna合成和dna合成中需要的嘌呤、嘧啶、嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成抑制了腫瘤細胞的存活和復制必不可少的代謝途徑，以及以細胞內的酶、核酸為作用靶而產生細胞毒性。近年來，隨著核苷轉移子、核苷代謝過程中的酶以及核苷的抗癌機制的不斷深人的研究，核苷類抗癌化療利取得了很大進展.從而猜測6bar也可以干擾或者直接作用于蛋白質、核酸的生物合成，而干擾腫瘤細胞和病毒復制，在抗腫瘤和抗病毒方面發揮著重要的作用。當用6bar處理肺癌細胞后導致細胞周期不同程度的受阻和(或者)凋亡。

技術實現要素：

本發明針對上述現有技術，本發明提供了6bar在人肺癌細胞株中抗腫瘤的應用。

本發明的技術方案：

一種細胞周期阻滯劑6bar在人肺癌細胞中的應用，步驟如下：

(1)細胞復蘇：將裝有凍存人肺癌細胞株a549的凍存管從-80℃冰箱中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕微搖動，待液體融化；將凍存管中的人肺癌細胞株a549懸浮于含有10％滅活胎牛血清的無菌rpmi1640培養液的離心管中，1000rpm，5min離心，離心結束后，棄上清，輕輕彈起細胞，再次入無菌rpmi1640培養液與離心管中，把細胞懸浮起來，轉移到培養瓶中左右輕輕搖動，使培養瓶中的細胞均勻分布，得到復蘇的人肺癌細胞株a549；

(2)細胞培養：將復蘇的人肺癌細胞株a549置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中培養，10h后觀察細胞，若已貼壁，將培養液全部吸出，再次加入等量的rpmi1640培養液；待細胞長至培養瓶底面積的70％～80％傳代1次；

(3)藥物配制：6bar先用0.1％dmso溶解，繼續用無菌rpmi1640培養基將用0.1％dmso溶解好的6bar稀釋，使6bar溶液的母液濃度達到1mm，繼續用無菌rpmi1640培養基將溶解好的6bar溶液的母液稀釋至濃度為1μm-500μm，過濾除菌，室溫保存；

(4)處理細胞：將處于對數生長期的細胞用胰酶消化，細胞計數后，稀釋，稀釋細胞密度為3×10⁴～5×10⁴個/ml，吹打混勻；將細胞接種于96孔板中，每孔取100μl人肺癌細胞株a549，12h后，待細胞貼壁后，設置7組實驗，每組4個復孔，第1組：空白對照組；第2組：0.1％dmso組；第3組：100μμ6bar組；第4組：50μμ6bar組；第5組：10μμ6bar組；第6組：5μμ6bar組；第7組：1μμ6bar組；分別向各組中加入10μl對應的藥物，輕輕混勻后，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中孵育2天，檢測細胞增殖抑制活性；

(5)檢測細胞增殖抑制率：將步驟(4)處理后的細胞，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中孵育48h，各4個復孔；采用mtt試劑盒進行檢測，每孔細胞懸液中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培養箱中孵育3h，測定490nm處各組細胞的吸光度，記錄數據；

(6)檢測細胞周期：將處于對數生長期的細胞用胰酶消化，細胞計數后，取適量細胞進行稀釋，稀釋細胞密度為1×10⁵～1.5×10⁵個/ml，吹打混勻，將細胞接種于6孔板中，每孔加入2ml人肺癌細胞株a549，12h后，待細胞貼壁后，設置空白對照組和10μμ6bar組，向10μμ6bar組中加入200μl6bar，控制其濃度為10μμ6bar，輕輕混勻后，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中孵育36h，用15ml離心管分裝成兩個樣品，按照細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書固定細胞，并配制碘化丙染色緩沖液，12h后，每個樣品中加入pbs洗多次，重懸細胞，每個樣品加入所需碘化丙染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗兩次；300目篩網過濾后用bdfacscalibur流式細胞儀上機檢測。

本發明的有益效果：本發明的數據建立在核苷類似物可干擾腫瘤細胞的dna合成和dna合成中需要的嘌呤、嘧啶、嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成抑制了腫瘤細胞的存活和復制的基礎之上。

附圖說明

圖1為不同濃度6bar對人肺癌細胞株增殖的抑制作用。

圖2為6bar對人肺癌細胞株a549細胞周期的影響。(a)為對照組。(b)為10μμ6bar處理36h后a549細胞的細胞周期。

具體實施方式

以下結合附圖和技術方案，進一步說明本發明的具體實施方式。

本發明使用的細胞、試劑盒以及試劑：人肺癌細胞株a549，胎牛血清、雙抗(青霉素/鏈霉素)，rpmi1640培養基，mtt試劑盒，細胞周期與凋亡染色試劑盒，6bar。

實施例1

6bar對人肺癌細胞株a549的體外增殖抑制活性：將復蘇的人肺癌細胞株a549培養于含有10％fbs滅活胎牛血清、1％青霉素/1％鏈霉素(雙抗)的無菌rpmi1640培養液中，置于懸浮細胞瓶中，在37℃、5％co2及飽和濕度下的培養箱中培養，細胞長至70％-80％左右傳代1次。繼續培養得到生長狀態活躍的人肺癌細胞株，收集細胞。將處于對數生長期的5×10³個細胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養液的96孔板中，按照實驗需求，處理組分別加入10μl的100μm、50μm、10μm、1μm濃度6bar，放入培養箱中孵育2天，各4個復孔。采用mtt試劑盒進行檢測，每孔細胞中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培養箱中孵育3h。測定490nm處各組細胞的吸光度，記錄數據，采用重復測量資料的方差分析方法來分析各組數據，結果如圖1所示。圖1可見，施用不同濃度的6bar對人肺癌細胞株a549的增殖速率顯著低于對照組，表明6bar可以抑制人肺癌細胞株a549的增殖速率。

實施例2

6bar誘導a549細胞凋亡：將處于對數生長期上述培養的細胞用胰酶消化，細胞計數后，取適量細胞進行稀釋，稀釋細胞密度為1×10⁵～1.5×10⁵個/ml，吹打混勻，將細胞接種于6孔板中，每孔取2ml人肺癌細胞株a549，12h后，待細胞貼壁后，設置空白對照組和10μμ6bar組，向10μμ6bar組中加入200μl100μμ6bar(工作濃度為10μμ6bar)，輕輕混勻后，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中孵育36h，用15ml離心管分裝成兩個樣品，按照細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書固定細胞并配制碘化丙染色緩沖液，12h后，每個樣品中加入10mlpbs洗兩次，重懸細胞，每個樣品加入500μl碘化丙染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗兩次；300目篩網過濾后用bdfacscalibur流式細胞儀上機檢測；結果如圖2所示，圖2可見，與對照組相比，施加6bar可以導致細胞周期阻滯在g0/g1期，從而在體外對人肺癌細胞株a549具有很強的毒性和促凋亡作用。當用6bar處理人肺癌細胞株a549后導致細胞周期受阻和(或者)凋亡。