支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法與流程

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法。

背景技術：

人支氣管上皮細胞主要功能：(1)支氣管表面的上皮細胞構成了基底柱狀結構，清除粘液纖毛。(2)由纖毛、無纖毛和能分泌黏液的細胞等混合細胞群組成物理屏障，可有效防止多種有毒物質。(3)產生和分泌大量化學介質和細胞因子形成高度復雜的宿主防御系統。人支氣管上皮細胞與主要病理生理疾病有關，如支氣管肺癌(多簡稱為肺癌)、慢性支氣管炎、支氣管擴張、支氣管狹窄。為了獲得體外穩定傳代的人正常支氣管上皮細胞，使人們可以更全面地研究細胞的正常功能，疾病發病機理，組織器官功能重建或再造，以及測定藥物對正常細胞的毒性，研究人員做出了大量的工作。

目前，傳統培養方法主要為：原代細胞的分離培養、ali培養基添加成分、預鋪膠原類型的選擇、細胞的接種密度等各不相同。

傳統培養方法缺陷在于：體外培養支氣管原代上皮細胞的存活率非常低。因此，有必要提供一種支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法，提高體外培養支氣管原代上皮細胞的存活率。

技術實現要素：

針對現有技術中的缺陷，本發明提供支氣管原代上皮細胞的培養與鑒定方法，以提高支氣管原代上皮細胞體外培養的成活率。

第一方面，本發明提供了支氣管原代上皮細胞的培養方法，包括如下步驟：

s1、用膠原蛋白鋪滿器皿的表面，包被處理后備用；

s2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，加入培養基內，點到包被好的培養皿中間培養至細胞鋪滿整個細胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液消化細胞孔，轉移到細胞培養瓶細胞培養箱培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

本發明中，作為一種優選的技術方案，步驟s1的詳細過程為：用無菌0.006-0.008mol/l乙酸將膠原蛋白稀釋到0.03-0.05mg/ml，在12孔板內每孔加300-400ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1-2小時后，用保護性毛刷洗3-5次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒30-40min后使用。

本發明中，作為一種優選的技術方案，所述膠原蛋白為鼠尾膠原蛋白(索萊寶)。

本發明中，作為一種優選的技術方案，步驟s2的詳細過程為：經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷3-4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養液的離心管內(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1000-1200rpm離心10-15分鐘，去上清后加入150-170ulbegm培養基，吸取30-50ul點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱培養4小時；取出以后加入500-600ul培養基，放細胞培養箱中培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔。

本發明中，作為一種優選的技術方案，所述細胞培養箱培養條件為37℃、5％co2。

本發明中，作為一種優選的技術方案，步驟s3的詳細過程為：用胰蛋白酶－edta消化液消化細胞孔5-10min，加入1mlrpmi1640培養液終止消化后，1500-1700rpm離心5-10分鐘，去上清后加入1mlbegm培養基，1600-1800rpm離心5-10分鐘，去上清后加入4mlbegm培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，1-2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

本發明中，作為一種優選的技術方案，胰蛋白酶－edta消化液的質量分數為0.25％。

第二方面，本發明提供了支氣管原代上皮細胞的鑒定方法，包括細胞免疫組化染色鑒定方法。

本發明中，作為一種優選的技術方案，細胞免疫組化染色鑒定方法的具體步驟為：

兔抗人的角蛋白8單克隆抗體標記支氣管上皮細胞：將爬片用無水乙醇洗三次，每次浸泡5min，然后取出爬片，自然晾干，把消化好的支氣管上皮細胞離心、計數以后，取5萬個細胞，接種于爬片上進行培養，定期光鏡下觀察，待爬片長滿細胞以后，爬片制作完成→4％多聚甲醛固定20min→pbs洗5min*3次→5％牛血清白蛋白室溫孵育1小時→pbs洗5min、3次→1:20稀釋一抗，取30ul，將爬片正面向下貼合一抗，放于濕盒中4℃冰箱孵育一整夜→pbs洗5min、3次→加入檢測試劑山羊抗兔igg/hrp聚合物15min→pbs洗5min、3次→dapi染色7min→pbs洗5min、3次→90％甘油封片→倒置相差顯微鏡下觀察。

由上述技術方案可知，本發明具有如下有益效果，

本發明能夠實現支氣管原代上皮細胞的體外培養和鑒定，操作方便、細胞存活率高。

附圖說明

圖1為本發明培養過程示意圖；

圖2為刷檢獲得的人支氣管上皮細胞，原代培養第1天，接種于begm培養基的細胞形態實物圖(x100)；

圖3為支氣管上皮細胞原代培養第3天的細胞形態實物圖(x400)；

圖4為支氣管上皮細胞原代培養第5天的細胞形態實物圖(x400)；

圖5為支氣管上皮細胞原代培養第11天的細胞形態實物圖(x100)；

圖6為支氣管上皮細胞原代培養第13天的細胞形態實物圖(x100)；

圖7為支氣管上皮細胞原代培養第15天的細胞形態實物圖(x100)；

圖8為支氣管上皮細胞原代培養第16天的細胞形態實物圖(x100)；

圖9為支氣管上皮細胞原代培養第17天的細胞形態實物圖(x100)；

圖10為支氣管上皮細胞原代培養第18天的細胞形態實物圖(x100)；

圖11為兔抗人細胞角蛋白8單克隆抗體進行細胞免疫組化染色，胞漿著色圖(x100)；

圖12為兔抗人細胞角蛋白8單克隆抗體進行細胞免疫組化染色，胞漿著色圖(x400)；

圖13為兔抗人細胞角蛋白8單克隆抗體進行細胞免疫組化染色，胞核復染圖(x100)；

圖14為兔抗人細胞角蛋白8單克隆抗體進行細胞免疫組化染色，胞核復染圖(x400)。

具體實施方式

下面將結合具體實施例對本發明技術方案進行詳細的描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發明的保護范圍。

實施例1

支氣管原代上皮細胞的培養方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.006mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.03mg/ml，在12孔板內每孔加300ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1小時后，用保護性毛刷洗3次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒30min后使用；

s2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷3次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養液的離心管內(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1000rpm離心10分鐘，去上清后加入150ulbegm培養基，吸取30ul點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱(細胞培養箱培養條件為37℃、5％co2)培養4小時；取出以后加入500ul培養基，放細胞培養箱中培養，1天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質量分數為0.25％)消化細胞孔5min，加入1mlrpmi1640培養液終止消化后，1500rpm離心5分鐘，去上清后加入1mlbegm培養基，1600rpm離心5分鐘，去上清后加入4mlbegm培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，1天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

實施例2

支氣管原代上皮細胞的培養方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.008mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.05mg/ml，在12孔板內每孔加400ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置2小時后，用保護性毛刷洗5次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒40min后使用；

s2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養液的離心管內(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1200rpm離心15分鐘，去上清后加入170ulbegm培養基，吸取50ul點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱(細胞培養箱培養條件為37℃、5％co2)培養4小時；取出以后加入600ul培養基，放細胞培養箱中培養，2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質量分數為0.25％)消化細胞孔10min，加入1mlrpmi1640培養液終止消化后，1700rpm離心5-10分鐘，去上清后加入1mlbegm培養基，1800rpm離心10分鐘，去上清后加入4mlbegm培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

實施例3

支氣管原代上皮細胞的培養方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.007mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.04mg/ml，在12孔板內每孔加350ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1.5小時后，用保護性毛刷洗4次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒35min后使用；

s2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養液的離心管內(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1100rpm離心13分鐘，去上清后加入160ulbegm培養基，吸取40ul點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱(細胞培養箱培養條件為37℃、5％co2)培養4小時；取出以后加入550ul培養基，放細胞培養箱中培養，1天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質量分數為0.25％)消化細胞孔8min，加入1mlrpmi1640培養液終止消化后，1600rpm離心8分鐘，去上清后加入1mlbegm培養基，1700rpm離心8分鐘，去上清后加入4mlbegm培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，1天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

實施例4

支氣管原代上皮細胞的培養方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.006mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.05mg/ml，在12孔板內每孔加300ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置2小時后，用保護性毛刷洗3次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒40min后使用；

s2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷3次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養液的離心管內(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1200rpm離心10分鐘，去上清后加入170ulbegm培養基，吸取30ul點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱(細胞培養箱培養條件為37℃、5％co2)培養4小時；取出以后加入600ul培養基，放細胞培養箱中培養，1天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質量分數為0.25％)消化細胞孔5min，加入1mlrpmi1640培養液終止消化后，1700rpm離心5分鐘，去上清后加入1mlbegm培養基，1800rpm離心5分鐘，去上清后加入4mlbegm培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

實施例5

支氣管原代上皮細胞的培養方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.008mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.03mg/ml，在12孔板內每孔加360ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1.5小時后，用保護性毛刷洗4次后，在超凈臺中利用風機吹干并用紫外消毒40min后使用；

s2、經支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細胞，力道均勻刷3-4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養液的離心管內(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內毛刷數次后，1000rpm離心10-15分鐘，去上清后加入170ulbegm培養基，吸取30ul點到包被好的細胞培養皿中央，放到細胞培養箱(細胞培養箱培養條件為37℃、5％co2)培養4小時；取出以后加入520ul培養基，放細胞培養箱中培養，2天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質量分數為0.25％)消化細胞孔7min，加入1mlrpmi1640培養液終止消化后，1550rpm離心10分鐘，去上清后加入1mlbegm培養基，1750rpm離心6分鐘，去上清后加入4mlbegm培養基，轉移到25cm²細胞培養瓶，放置細胞培養箱培養，1天換液一次，至細胞鋪滿整個細胞瓶。

選擇實施例3培養過程進行細胞形態學觀察，過程如下：

刷檢獲得的支氣管上皮細胞，收集、離心以后，接種于begm培養基，細胞形態桿狀透明，呈單個、散在分布，懸浮于培養基中，鏡下可見纖毛擺動，見圖2；第2-3天，細胞逐漸貼壁、變大，呈多邊形，細胞聚集成團，部分生長旺盛者，呈鋪路石樣，見圖3；第5到6天，細胞逐漸增殖，數量增多，體積變大，細胞大小不一，較小的細胞團塊融合成片狀，見圖4；第7--12天細胞生長旺盛，大小均勻一致，可見大片的扁平狀、多邊形，密集呈鋪路石樣分布生長，約占整個孔的80％--90％，見圖5；第13天，將孔板上的細胞消化、離心，接種于細胞培養瓶，鏡下見細胞呈單個、散在分布，懸浮于培養基中，見圖6；第15天，細胞接種于細胞培養瓶1--2天，逐漸貼壁，呈多邊形，散在分布，少數聚集成團，見圖7；第16天，細胞增多，鋪路石樣生長，細胞團變大，見圖8；第17天，細胞體積逐漸變大，細胞數目逐漸增多，相鄰較小的細胞團塊逐漸融合呈片狀，見圖9；第18天，細胞增值明顯，可見大片的扁平狀、多邊形細胞，密集呈鋪路石樣分布生長，細胞大小均勻一致，增殖成片狀，約占瓶壁的70％-80％，見圖10；第20天，凍存細胞。

支氣管原代上皮細胞存活率測定

原代支氣管上皮細胞經消化、離心后，臺盼藍染色，鏡下可見，活細胞為無色透明細胞，鏡下為強光點，提示細胞活性高，死細胞被染成藍色；

臺盼藍染色以后，計數，測定細胞存活率。隨機選取三個實施例作為樣本，臺盼藍染色以后分別計數，活細胞/細胞總數分別為97.39％、99.60％、93.40％，平均細胞存活率為96.80％。

支氣管上皮細胞免疫組化染色鑒定實施例

選擇實施例3得到的培養后的細胞，采用細胞免疫組化染色鑒定方法進行鑒定，具體步驟為：兔抗人的角蛋白8單克隆抗體標記支氣管上皮細胞：將爬片用無水乙醇洗三次，每次浸泡5min，然后取出爬片，自然晾干，把消化好的支氣管上皮細胞離心、計數以后，取5萬個細胞，接種于爬片上進行培養，定期光鏡下觀察，待爬片長滿細胞以后，爬片制作完成→4％多聚甲醛固定20min→pbs洗5min、3次→5％牛血清白蛋白室溫孵育1小時→pbs洗5min、3次→1:20稀釋一抗，取30ul，將爬片正面向下貼合一抗，放于濕盒中4℃冰箱孵育一整夜→pbs洗5min、3次→加入檢測試劑山羊抗兔igg/hrp聚合物15min→pbs洗5min、3次→dapi染色7min→pbs洗5min、3次→90％甘油封片→倒置相差顯微鏡下觀察。

原代培養的支氣管上皮細胞經消化、離心，爬片以后，用兔抗人細胞角蛋白8單克隆抗體進行細胞免疫組化染色鑒定，光鏡下，支氣管上皮細胞胞漿著色為綠色，見圖11、12；胞核復染為藍色，見圖13、14。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求和說明書的范圍當中。