一種用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針、制備方法及其應用與流程

本發明涉及生物檢測領域，特別涉及對于細胞內巰基次磺酸化蛋白質原位顯影，并通過熒光共振能量轉移fret原理定量檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針的制備和應用。

背景技術：

氧化應激是指在各種內外因素刺激作用下，生物體內的活性氧，即過氧化氫、超氧陰離子、烷氧自由基、羥自由基等(reactiveoxygenspecies,ros)產生過多或發生代謝障礙，并且內源性抗氧化防御系統不能對其有效消除時，ros在體內增多并參與氧化生物大分子，誘發基因突變、蛋白質修飾變性和脂質過氧化，進而損傷溶酶體、線粒體等，最終導致細胞的氧化損傷。氧化應激已被證實與多個系統疾病的發生有著密切聯系，尤其是阿茲海默病、帕金森氏病、亨丁頓舞蹈癥等神經退行性疾病；這些疾病發生過程中氧化應激導致腦細胞凋亡、自噬等過程造成組織損傷和病變。其中，次磺酸化蛋白是ros氧化蛋白質的關鍵中間產物，即蛋白質巰基-sh被ros氧化后轉化為次磺酸基團-soh，次磺酸基團-soh可被還原為硫醇/巰基狀態，或繼續氧化為亞磺酸和磺酸。因此，次磺酸化蛋白質是機體和細胞感受氧化應激的重要瞬時標志物，是表征氧化應激進程的重要信號。近年來蛋白質巰基次磺酸化修飾作為一個新興的研究熱點,越來越受到科學家的重視,發展能對生物體內巰基次磺酸化修飾進行實時追蹤檢測的方法,可極大推動相關的生物氧化應激機制及生理病理學研究。

早期的巰基次磺酸化修飾檢測方法主要是利用比色法、間接法(先把樣品中巰基選擇性封閉，再用亞砷酸將次磺酸基團還原成巰基測定其含量)。但存在定量分析檢測限高或反應步驟多的缺點。目前應用最廣泛、體系發展最成熟的是生物素開關法,該法目前雖然接受度高,準確度好,但存在操作步驟繁瑣、樣本必須通過分離后進行質譜檢測，很難應用于活細胞成像及實時監測等缺點。也無法獲取蛋白質巰基次磺酸化修飾后動態變化等任何信息。小分子熒光探針成像由于靈敏度高,操作簡單,可用于活體檢測,近年來已成為檢測完整生物樣本的理想而不可缺少的輔助工具。

但是現有的熒光小分子探針存在以下問題：一是穩定性不夠好，不能長期保存；二是使用時吸收發射波長差較小,不能夠有效避免激發光的干擾，三是靈敏度相對不夠高，四是選擇性較小，適用范圍不夠廣。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針、制備方法及其應用，該熒光探針能夠對細胞內巰基次磺酸化蛋白質原位顯影，并通過熒光共振能量轉移fret原理定量檢測次磺酸化蛋白質。

本發明的用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針，具有如下結構通式(ⅰ)：

其中，x為化學單鍵或者為中的一種；r為具有親核性碳原子中心結構的基團；

進一步，結構通式(ⅰ)中，所述r為

中的一種。

本發明還公開一種用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針的制備方法，所述用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針經可識別次磺酸的化合物與熒光化合物經縮合反應制得；

進一步，所述可識別次磺酸的化合物包括帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸或者其衍生物；

進一步，所述可識別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑作為縮合劑,經研磨，與溴乙胺或者對氨苯甲酸發生縮合反應，其化學反應式如下：

進一步，所述可識別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑作為縮合劑,經研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發生縮合反應，其化學反應式如下：

進一步，所述可識別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸衍生物，加入三乙胺作為縮合劑和溶劑，經研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發生縮合反應，其化學反應式如下：

進一步，還包括縮合反應后經萃取分離純化的步驟；

本發明還公開一種用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針在檢測蛋白質巰基次磺酸化修飾中的應用。

本發明的有益效果：熒光小分子探針定量檢測次磺酸化蛋白質是基于熒光共振能量轉移fret原理。fret原理是：兩個熒光發色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移。fret發生條件：a.能量匹配:供體分子的發射光譜可以被受體分子吸收并產生熒光信號。供體分子的發射光譜應與受體分子的激發光譜必須有顯著重疊(>30％)；b.作用距離：供體分子與受體分子的作用距離為1-10nm。

本發明利用次磺酸-soh與含有親核性的α-碳原子類化合物間,發生親核取代反應,設計可與蛋白質中次磺酸化位點特異性反應的熒光探針,這些熒光探針本身在親水性環境中熒光較弱,與-soh反應后可生成疏水性、具有較強熒光的加合產物,因而可用于蛋白質次磺酸化修飾程度的靈敏檢測。其測定原理是蛋白質中的色氨酸殘基作為fret的熒光供體其最大發射波長在330nm左右，熒光小分子探針的熒光基團作為fret的熒光受體其激發譜的范圍在330nm左右。fret原理實現的條件是：反應前，熒光小分子探針的熒光基團與次磺酸化蛋白質的色氨酸殘基相距可超過10nm；反應后，熒光小分子探針的熒光基團與次磺酸化蛋白質的色氨酸殘基相距可小于2nm。

本發明的熒光探針穩定性好,能夠長期保存使用；對于環境很敏感，探針在親水環境中(如細胞胞漿)本身熒光不強，只有在與次磺酸化蛋白反應后熒光基團處于蛋白質結構內疏水環境，產生較強熒光，能在細胞內原位顯影巰基次磺酸化蛋白質。同時，具有良好的水溶性和較大的吸收發射波長差，在細胞外水溶液檢測體系，與蛋白質中色氨酸殘基(其發射波長與探針激發波長重疊)能夠配對產生熒光共振能量轉移fret效應，有效避免激發光和蛋白質樣品中發射光的干擾能在復雜生物樣品中特異性地定量檢測次磺酸化蛋白質，檢測信噪比高，靈敏度好，具有優秀的選擇性。從而實現對細胞內蛋白質巰基次磺酸化修飾的特異性檢測。

本發明的熒光探針法除適用于檢測細胞樣本、血漿、組織勻漿中次磺酸化修飾程度,還適用于細胞甚至是動物組織中次磺酸化修飾的動態檢測。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述：

圖1是熒光探針分子ⅰ-1與次磺酸化牛血清白蛋白(bsa-soh)反應前后的熒光變化；

圖2是熒光探針分子ⅰ-1對次磺酸化牛血清白蛋白(bsa-soh)的選擇性；

圖3是熒光探針分子ⅰ-1對次磺酸化牛血清白蛋白(bsa-soh)濃度依賴性熒光增強；

圖4是熒光探針分子ⅰ-1檢測細胞中次磺酸化蛋白；

具體實施方式

本實施例的用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針，具有如下結構通式(ⅰ)：

其中，x為化學單鍵或者為中的一種；r為具有親核性碳原子中心結構的基團；穩定性好,能夠長期保存；使用具有較大的吸收發射波長差(>170nm),能夠有效避免激發光的干擾；檢測信噪比高,靈敏度好，且具有優秀的選擇性。其中，“x為化學單鍵”的意思為：r直接與-nh-單鍵連接。

本實施例中，結構通式(ⅰ)中，所述r為

中的一種，為r的優選基團。

本實施例的用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針的制備方法，所述用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針經可識別次磺酸的化合物與熒光化合物經縮合反應制得。可識別次磺酸的化合物如氰基乙酸，參與反應的物質添加量以能徹底反應完成為標準添加量，方法簡單，易操作。

本實施例中，所述可識別次磺酸的化合物包括帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸或者其衍生物；r只能與次磺酸-soh感應，利用次磺酸-soh與含有親核性的α-碳原子類化合物間,發生親核取代反應,設計可與蛋白質中次磺酸化位點特異性反應的熒光探針,這些熒光探針本身在親水性環境中熒光較弱,與-soh反應后可生成疏水性、具有較強熒光的加合產物,因而可用于蛋白質次磺酸化修飾程度的靈敏檢測。

本實施例中，所述可識別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑(cdi)作為縮合劑,經研磨，與溴乙胺或者對氨基苯甲酸發生縮合反應，其化學反應式如下：

本實施例中，所述可識別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸，在咪唑鹽酸鹽及微量水存在的條件下,以n,n'-羰基二咪唑作為縮合劑,經研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發生縮合反應，其化學反應式如下：

本實施例中，所述可識別次磺酸的化合物為帶有次磺酸-soh特征識別基團的羧酸衍生物，加入三乙胺作為縮合劑和溶劑，經研磨，與8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽發生縮合反應，其化學反應式如下：

本實施例中，還包括縮合反應后經萃取分離純化的步驟；

本發明還公開一種用于檢測次磺酸化蛋白質的熒光探針在檢測蛋白質巰基次磺酸化修飾中的應用：以定位顯色細胞中次磺酸化蛋白的應用為例,可通過以下步驟實現：細胞經過100μm過氧化氫(h2o2)氧化處理30min,用0.05％戊二醛水溶液固定細胞15min,pbs緩沖溶液洗三次，細胞浸潤在pbs溶液中，向其中加入式ⅰ所示的熒光探針,使其終濃度為200μm,25℃下避光孵育4小時(或者搖床避光慢速搖勻30min),觀察記錄細胞熒光強度,本發明提供的熒光探針的特征在于它的熒光基團本身在親水性生理環境中的熒光量子產率較弱,當與細胞中次磺酸化蛋白的-soh基團特異性快速反應后,熒光基團處于蛋白質疏水結構中，其熒光量子產率大大提高,實現至倍熒光增強,從而實現蛋白質次磺酸化修飾的特異性檢測和定量分析。

下面通過具體實施例對本發明做進一步的闡述。

實施例一

熒光探針分子ⅰ-1(結構式：)的制備：

稱取85mg氰基乙酸(85.06，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監測氰基乙酸完全反應，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監測8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應。加入10ml水和3×15ml乙酸乙酯，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產物ⅰ-1。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z515.9502。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ111.17,116.77,119.30,119.91,124.64,131.52,133.67,135.54,138.78,139.57,141.75,144.62,170.08。

熒光探針分子ⅰ-1與次磺酸化牛血清白蛋白bsa-soh反應前后的熒光變化：

將探針分子少量溶解在20mmpbs緩沖液中,分別加入pbs緩沖液或次磺酸化牛血清白蛋白的溶液,使探針分子的終濃度為10μm,而待測樣品的終濃度為10μm。反應5分鐘后，使用熒光分光光度計以280nm激發,記錄和計算溶液在發射波長范圍下的熒光強度面積積分,進而確定探針分子與反應后熒光強度增強,如圖1所示。

熒光探針分子ⅰ-1對次磺酸化牛血清白蛋白bas-soh的選擇性：

配置探針分子的pbs溶液,分別加入10μm待測樣品的pbs溶液,使探針分子的終濃度為10μm。反應5分鐘后，使用熒光分光光度計以280nm激發,記錄和計算溶液在發射波長范圍下的熒光強度面積積分,計算熒光增強倍數,進而確定探針分子對bsa-soh的選擇性，如圖2所示。

熒光探針分子ⅰ-1對次磺酸化牛血清白蛋白的濃度依賴性熒光增強：

將探針分子溶解在20mmpbs緩沖液中,分別加入不同濃度的次磺酸化牛血清白蛋白溶液,使探針分子的終濃度為10μm，反應5分鐘后使用熒光分光光度計以280nm激發,記錄和計算溶液在發射波長范圍下的熒光強度面積積分,計算熒光增強倍數,進而確定探針分子對濃度依賴性熒光增強,如圖3所示。

熒光探針分子檢測細胞中次磺酸化蛋白：

將人肺腺癌細胞a549接種于中號培養皿上,含10％胎牛血清的1640培養液中，置于細胞培養箱中37℃孵育12小時。隨后，用pbs沖洗三次，加入h2o2使其終濃度為100μm，放入37℃細胞培養箱，30分鐘后取出。然后，加200μl濃度為0.05％的戊二醛水溶液固定細胞，15分鐘后，用pbs沖洗1-2次。加入含有熒光探針ⅰ-1的pbs溶液，使其終濃度為100μm，避光放置4個小時。每次用1mlpbs溶液浸洗2次。采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察,拍照。其中采用405nm波長激發。結果表明,熒光探針分子可有效檢測到人肺腺癌細胞a549次磺酸化化產物,如圖4所示。

實施例二

熒光探針分子ⅰ-2(結構式：)的制備：

稱取85mg氰基乙酸(85.06，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監測氰基乙酸完全反應，再向研缽中稱入205mg溴乙胺氫溴酸鹽(204.89，1eq)和10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)，研磨30分鐘，加入10ml水和3×15ml二氯甲烷，收集有機層，干燥濃縮得到中間產物。在研缽中，加入中間產物，2ml三乙胺和384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)，研磨20分鐘，10ml水和3×15ml二氯甲烷萃取，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產物ⅰ-2。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z558.9416。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ8.34,39.55,46.71,111.02,116.42,119.40,124.60,126.04,131.36,133.78,135.65,137.21,139.97,142.22,169.96。

實施例三

熒光探針分子ⅰ-3(結構式：)的制備：

稱取85mg氰基乙酸(85.06，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監測氰基乙酸完全反應，再向研缽中稱入137mg對氨基苯甲酸(137.14，1eq)和10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)，研磨30分鐘，加入10ml水和3×15ml二氯甲烷，收集水層，水層—60℃冷凍干燥得到中間產物。在研缽中，加入中間產物和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監測氰基乙酸完全反應，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監測8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應。在研缽中，加入10ml水和3×15ml二氯甲烷萃取，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產物ⅰ-3。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z634.9333。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ8.04,46.36,110.91,114.79,116.39,118.76,120.41,124.45,127.77,129.95,130.68,131.17,134.64,135.37,137.25,138.91,139.74,140.69,141.90,144.65,154.10,164.84,169.79,174.72.

實施例四

熒光探針分子ⅰ-4(結構式：)的制備：

稱取156mg3,5-二羰基環已酸(156.14，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監測氰基乙酸完全反應，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監測8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應。加入10ml水和3×15ml乙酸乙酯，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產物ⅰ-4。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z586.9218。¹³cnmr(126mhz,d2o)δ37.56,42.54,99.99,111.26,116.93,118.98,120.05,124.71,131.66,133.35,135.63,138.77,139.54,141.73,144.62,182.66,197.71。

實施例五

熒光探針分子ⅰ-5(結構式：)的制備：

稱取200mg(苯磺酰基)乙酸(200.22，1eq)和178mgn,n'-羰基二咪唑cdi(162.14，1.1eq)，50℃在研缽中研磨5分鐘，tlc薄層色譜板監測氰基乙酸完全反應，再向研缽中稱入384mg8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽水合物(427.3，0.9eq)、10.4mg咪唑鹽酸鹽(104，0.1eq)及100μl水，研磨10分鐘，tlc薄層色譜板監測8-氨基-1，3，6-萘磺酸二鈉鹽完全反應。加入10ml水和3×15ml乙酸乙酯，分液萃取，水層—60℃冷凍干燥，得到黃色固體產物ⅰ-4。hrms(esi-tof)[m+na]⁺:m/z630.8895。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。