一種離子液體誘導的CIK細胞及其應用的制作方法

本發明屬于細胞免疫領域，具體涉及一種離子液體誘導的cik細胞及其應用。
背景技術：
：胃癌是世界上排名第四的惡性腫瘤，全球每年約有70多萬人死于胃癌，占全部惡性腫瘤死亡人數的10％左右。我國最新公布的腫瘤數據顯示，胃癌的發病率和死亡率分別位居全國第二和第三。胃癌常好發于50歲以上的中老年人并逐漸呈現年輕化的趨勢。因此，研發胃癌新型治療技術，解決胃癌相關的重大科學問題，是保障人口健康、維持社會經濟高速穩定發展、保障戰略順利實施的迫切需求。生物治療是繼手術、化療及放療3種傳統模式之后的第4大腫瘤治療模式，前3種模式或毒副作用較大，或不能清除體內殘存腫瘤細胞，大部分腫瘤患者終因復發或難治而導致死亡。細胞免疫治療技術在腫瘤的生物治療中占有重要地位,顯示出良好的應用前景，并逐漸成為胃癌治療的重要手段之一。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-inducedkillercell，cik)是近年來發現的一種非常有前景的過繼免疫細胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優點，已經成為腫瘤生物免疫治療的主力軍。cik細胞的主要效應細胞為cd3+cd56+表型t淋巴細胞，兼有nk細胞和t細胞的特征。在功能上，cik一方面擁有t淋巴細胞強大抗腫瘤活性，另一方面擁有nk細胞非mhc限制性的殺傷腫瘤的特點，其增殖迅速、對正常造血影響輕微。因此，如何提高細胞免疫治療中效應細胞的數量與活性對胃癌治療具有重要意義。技術實現要素：本發明旨在提供一種離子液體誘導的cik細胞及其應用，該cik細胞具有更強的殺傷腫瘤活性；本發明提供的離子液體可以顯著提高cik細胞的增殖力，提高其殺瘤活性。本發明通過如下技術方案得以實現：一種離子液體用于cik細胞培養以提高cik細胞增殖活力和腫瘤殺傷活性的用途，所述離子液體為咪唑類離子液體，其陽離子的化學結構式如下：其中，m取4或6。優選地，所述咪唑類離子液體的陰離子為溴離子或氯離子，離子液體的化學結構式如下：優選地，所述腫瘤為胃癌。一種cik細胞，經上述離子液體誘導獲得。一種細胞制劑，含有上述的cik細胞。上述的cik細胞在腫瘤治療方面的應用。優選地，所述腫瘤為胃癌。本發明優點：本發明提供了一種咪唑類離子液體用于cik細胞培養以提高cik細胞增殖活力和腫瘤殺傷活性，該離子液體與cik細胞誘導培養后可以顯著提高cik細胞增殖活力和腫瘤殺傷活性。附圖說明圖1為離子液體的化學結構式；圖2為各組cik細胞培養12天后的增殖倍數；圖3為各組cik細胞對mgc-803細胞的體外殺傷率(％)；圖4為各組cik細胞對胃癌mgc-803移植瘤的體內抑瘤率(％)。具體實施方式為了更好地解釋本發明的技術方案，下面結合具體實施例進一步介紹。實施例中未特別強調的實驗材料均為常規實驗材料，屬于本領域技術人員易于獲得的范疇。一、實驗材料10％胎牛血清和rpmi-1640培養液購于gibco公司，淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司(tbd)，il-2購自北京雙鷺藥業股份有限公司，抗人cd3單抗購自gibco公司，ifn-γ購自美國peprotec公司，il-1α購自美國peprotec公司，cck-8試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；編號1-4的離子液體由公司合成部合成，結果如圖1。balb/c裸鼠，均選用雌性裸鼠，鼠齡6-7周，體重18-23g，在spf條件下的裸鼠室內飼養，由南京大學實驗動物中心提供。胃癌mgc-803細胞購自上海歌凡生物細胞庫。二、實驗方法1、cik細胞的分離和培養(1)單個核細胞的分離：采集健康志愿者外周血，預冷的pbs1:1稀釋，緩慢加入淋巴細胞分離液上層，650g，4℃離心20min，收集白色細胞層，分離單個核細胞，rpmi-1640培養基重懸細胞后置于37℃，5％co2孵箱中孵育2h。(2)cik細胞的培養：收集單核細胞中的懸浮細胞，調整細胞密度至2.5×106/ml，均分為五組進行培養，分組及培養方法如下：常規組：0天時，在完全培養基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)，放入5％co2、37℃培養箱中孵育24h后，添加il-2(500u/ml)、il-1α(l00u/ml)和抗人cd3單抗(20μg/ml)。每2-3d進行換液，并補充等量的細胞因子，在培養過程中，添加新鮮培養基前用臺盼藍染色檢測細胞的活率，統計細胞的絕對數目；連續培養12天，收集細胞；誘導a組：0天時，在完全培養基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和編號1的咪唑類離子液體(40nm)，放入5％co2、37℃培養箱中孵育24h后，按照常規組后續方法培養，統計細胞的絕對數目，收集細胞；誘導b組：0天時，在完全培養基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和編號2的咪唑類離子液體(50nm)，放入5％co2、37℃培養箱中孵育24h后，按照常規組后續方法培養，統計細胞的絕對數目，收集細胞；誘導c組：0天時，在完全培養基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和編號3的咪唑類離子液體(40nm)，放入5％co2、37℃培養箱中孵育24h后，按照常規組后續方法培養，統計細胞的絕對數目，收集細胞；誘導d組：0天時，在完全培養基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和編號4的咪唑類離子液體(50nm)，放入5％co2、37℃培養箱中孵育24h后，按照常規組后續方法培養，統計細胞的絕對數目，收集細胞。2、cik細胞的體外腫瘤殺傷活性使用cck-8法檢測體外各組cik細胞對胃癌mgc-803細胞的殺瘤活性，以對數生長期的mgc-803細胞作為靶細胞，待貼壁培養24h后，分別以培養12天的各組cik細胞作為效應細胞，分別置于37℃、5％co2、飽和濕度下的細胞培養箱中，待貼壁24h后，按效靶比為10:1加入效應細胞，設效應細胞對照與靶細胞對照，每組3個復孔，效應細胞與靶細胞共培養24h后，每孔按10％的體積加入cck-8溶液，置于培養箱中繼續孵育培養4h后，酶聯免疫撿測儀選擇波長為450nm測定各孔光吸光值，并按照下式計算殺傷活性(殺傷率)：殺傷率＝[1-(實驗組od值-效應細胞組od值)/靶細胞組od值]×l00％。3、cik細胞的體內腫瘤殺傷活性將balb/c裸鼠右腋皮下接種0.2ml1×106/mlmgc-803胃癌細胞后，再隨機分成6組：對照組、常規組、誘導a-d組，每組20只。10d后常規組、誘導a-d組的每只裸鼠在接種腫瘤細胞部位處注射0.2ml1×107/ml的cik細胞(分別對應按照上述常規組、誘導a-d組誘導培養12天)，對照組裸鼠注射0.2ml生理鹽水，連續注射5d。15d后每組剝離腫瘤塊并稱重，按照如下公式計算抑瘤率(％)：抑瘤率＝(對照組瘤質量-實驗組瘤質量)/對照組瘤質量×100％4、統計學分析使用spss20.0統計學軟件進行t檢驗，p<0.05認為差異顯著。三、實驗結果1、各組cik細胞的增殖與活率接種時各組都為2.5×106個細胞，培養至第12天時，常規組的細胞絕對數目為(452.46±28.29)×106個，增殖倍數約為181倍左右；誘導a-d組的細胞絕對數目分別為(712.38±42.36)×106、(694.55±40.28)×106、(676.86±45.28)×106、(788.28±45.96)×106個，增殖倍數分別約為284、278、271、318倍左右，與常規組相比具有顯著性差異(p＜0.05)。每次補液前采用臺盼藍染色細胞活率檢測，且都保持在95％左右，培養至第12天時，常規組培養制備的細胞活率為(95.02±1.43)％，誘導a-d組培養制備的細胞活率分別為(94.85±1.77)％、(95.64±1.82)％、(94.18±1.48)％、(95.84±1.89)％。各組cik細胞培養12天后的增殖倍數如圖1所示。2、體外各組cik細胞對胃癌mgc-803細胞的殺瘤活性分別取培養至第12天時各組cik細胞對mgc-803細胞進行殺傷實驗，在效靶比為10:1時，各組cik細胞均表現出明顯的殺瘤活性，其中誘導a-d組制備的cik細胞比常規組制備的cik細胞具有更強的殺瘤活性，且差異顯著(p＜0.05)。各組cik細胞對mgc-803細胞的殺傷率如表1和圖3所示。表1體外各組cik細胞對胃癌mgc-803細胞的殺傷率常規組誘導a組誘導b組誘導c組誘導d組殺傷率(％)38.46±2.1356.27±3.0854.86±2.7960.36±3.5358.25±2.963、體內各組cik細胞對胃癌移植瘤的殺瘤活性全部實驗裸鼠在接種第7天時在接種部位均有腫瘤形成，直徑為0.8-1cm。cik細胞干預15天后，常規組、誘導a-d組所有裸鼠的腫塊均有所縮小，而對照組所有裸鼠的腫塊均增大。解剖時發現，與對照組相比，常規組、誘導a-d組的腫瘤塊較小且局限，而對照組的腫瘤塊大且有腫瘤局部浸潤現象。各組腫瘤塊質量以及常規組、誘導a-d組抑瘤率見表2和圖4。表2各組腫瘤塊質量以及常規組、誘導a-d組抑瘤率腫瘤塊質量(g)抑瘤率(％)對照組2.64±0.32/常規組1.39±0.2047.3誘導a組0.86±0.1167.4誘導b組0.92±0.1965.2誘導c組0.81±0.1469.3誘導d組0.85±0.1267.8從上表可以看出，誘導a-d組比常規組具有更優的體內抑瘤率，差異顯著(p＜0.05)。綜上可以看出，本發明提供了一種咪唑類離子液體用于cik細胞培養以提高cik細胞增殖活力和腫瘤殺傷活性，該離子液體與cik細胞誘導培養后可以顯著提高cik細胞增殖活力和腫瘤殺傷活性。上述實施例僅用于進一步解釋本發明的技術方案，本領域技術人員應當明白，任何簡單替換或修改均不脫離本發明，本發明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。當前第1頁12