分子信標探針及引物對、GC基因SNPs位點檢測方法與流程

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種分子信標探針及引物對、gc基因snps位點檢測方法。

背景技術：

維生素d結合蛋白(group-specificcomponent/vitamindbindingprotein，gc)最初被稱為“種群特異性成分(沿用gc作為其正式縮寫的原因)”，是白蛋白超家族的一員，存在于血漿等多種體液和多種類型的細胞表面。在血漿中，gc能夠與大部分維生素d或其代謝產物結合，并將其運輸到靶組織；同時，gc還具有其它功能，如清除胞外肌動蛋白、轉運脂肪酸、結合內毒素、保護并增強補體因子c5a功能、影響t細胞反應、調節巨噬細胞和破骨細胞，從而在脂代謝、免疫反應、骨健康等方面發揮特定作用。

編碼gc蛋白的基因在人染色體上定位為4q13.3，具有超過200多種單核苷酸多態性位點和相應基因型，其中三種最主要的基因型是根據位于第11號外顯子上的rs7041和rs4588兩個snps判定的。已知rs7041的g/t多態性和rs4588的a/c(最新數據顯示有極其罕見的t)多態性在單倍體中的基因型為g-c、t-c和t-a三種(沒有g-a)，文獻習慣上分別用1s、1f和2表示這三種單倍體基因型[對應第432與436(原第416與420)位的氨基酸分別是glu與thr、asp與thr和asp與lys]，并可組合成6種二倍體基因型，即1f/1f、1s/1s、2/2、1f/1s、1f/2和1s/2。這些snps所致的氨基酸差異會導致血漿gc濃度差異，并可能對gc蛋白的功能產生不同程度的影響而使人體可能表現出差異的表型或健康效應。gc濃度差異也可能通過影響血循環25羥維生素d(25-hydroxyvitamind，25ohd)濃度水平而產生維生素d營養水平差異相關的表型。已知有9.9％的血循環25ohd濃度水平差異與上述rs7041和rs4588這兩個snps有關。因此，對人群的這兩個snps進行檢測，對分析gc基因與多種疾病風險和表型的相關性具有研究與預測價值。

針對rs7041和rs4588兩個snps的基因型分析，最早用多種檢測技術同時進行驗證分析的論文發表于1992年。該研究旨在分析鑒定這兩個snps在人群中實際存在的情況，采用的方法包括：聚合酶鏈式反應后的限制性酶切片段長度多態性分析(pcr-rflp)、taqman探針和測序三種。后來研究采用的方法還包括：等位基因特異性競爭pcr基因分型法、芯片法等。pcr-rflp雖然廉價，但其操作步驟繁瑣，且需要兩個獨立的rflp實驗進行基因分型，在分析大量樣本時，尤其費時。taqman探針、kasp和goldengate等技術也不能在一次反應中同時對兩個多態性位點進行分析。以taqman探針不論混合還是單獨反應分析這兩個相距10bp的rs7041和rs4588時，都需精心設計、測試多套探針，增加了試劑成本。kasp、goldengate、時間飛行質譜、測序等方法都依賴于昂貴的設備、封閉的試劑和較高的實驗操作技術，甚至需要摸索建立適宜的檢測條件；且因其單次運行所需試劑用量有最低要求，間歇與隨時開機運行的成本較高。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種分子信標探針及引物對、gc基因snps位點檢測方法，旨在解決現有gc基因snps位點檢測步驟繁瑣、耗時、成本高的技術問題。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一方面，本發明提供一種用于檢測gc基因snps位點的分子信標探針，所述分子信標探針用于同時檢測gc基因多態性位點rs7041和rs4588，包括依次連接的上游序列、核心序列和下游序列，其中，所述核心序列為：5’-[g/t]gccacaccca[a/c]-3’或5’-[g/t]tgggtgtggc[a/c]-3’，所述上游序列和所述下游序列均包括：至少三個與gc基因互補配對的堿基或至少兩個與gc基因互補配對的c或g堿基；

同時，所述分子信標探針的長度為25-35bp，tm值為62-65℃，所述分子信標探針的5’端和3’端分別用熒光報告基團和熒光淬滅基團標記。

另一方面，本發明提供一組用于檢測gc基因snps位點的分子信標探針和引物對，所述分子信標探針為上述分子信標探針，且所述引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物和所述第二引物的長度均為20-30bp；且所述第一引物包含5’-ggcagagcg-3’，所述第二引物包含5’-ggaggc-3’或5’-gaggt-3’。

再一方面，本發明提供一種用于檢測gc基因snps位點的試劑盒，包括上述分子信標探針和引物對，還包括taqhs酶、dntps、pcr緩沖液。

最后，本發明提供一種gc基因snps位點的檢測方法，包括如下步驟：

提取dna樣本；

將所述dna樣本與上述試劑盒配成pcr反應體系，進行pcr擴增；

根據所述擴增結果分析樣本中gc基因snps位點。

本發明提供的分子信標探針，其核苷酸序列可覆蓋gc基因的rs7041和rs4588兩個snps位點，僅需要qpcr儀和一條熒光標記的分子信標探針，即可實現對大量樣品的gc基因中兩個重要多態性位點的分析，加上qpcr儀運行成本和操作技術要求相對較低，這就大大降低了檢測成本和分析難度。

同時，設計一組與該分子信標探針配套的引物對，一條(第一引物)位于rs7041上游100bp范圍內的特異性引物，另一條(第二引物)位于rs4588下游100bp范圍內的特異性引物。rs7041上游100bp的適宜引物都有共同位置上9bp的片段5’-ggcagagcg-3’；rs4588下游100bp的適宜引物有兩群，一群具有6bp的共同位置片段5’-ggaggc-3’，另一群具有5bp的共同位置片段5’-gaggt-3’；這樣可實現對大量樣品的gc基因中兩個重要多態性位點的分析。

該用于檢測gc基因snps位點的試劑盒，因含有本發明特有的分子信標探針和引物對，所以具有高效、靈敏、特異性強的特點，而且該試劑盒成本低、使用方便，僅需要qpcr儀可實現對大量樣品的gc基因中兩個重要多態性位點的分析。

該gc基因snps位點的檢測方法，因使用本發明特有的試劑盒，根據熒光信號在熔解曲線程序中出現的峰型判斷gc不同的基因型。因此具有檢測步驟簡單、耗時少、成本低的特點。

附圖說明

圖1為本發明實施例2中同時檢測由rs7041和rs4588組成的6種基因型原始數據圖；

圖2為本發明實施例2中同時檢測由rs7041和rs4588組成的6種基因型原始數據處理圖；

圖3為本發明實施例2中rs7041和rs4588組成的6種基因型的pcr檢測產物測序結果圖；

圖4為本發明實施例2中同時檢測由rs7041和rs4588組成的6種基因型的大量樣本原始數據圖；

其中，附圖標記為：

1：gc-1s/1s；2：gc-1f/1f；3：gc-2/2；

4：gc-1s/1f；5：gc-1s/2；6：gc-1f/2。

具體實施方式

為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖和實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

一方面，本發明實施例提供了一種用于檢測gc基因snps位點的分子信標探針，其用于同時檢測gc基因多態性位點rs7041和rs4588，包括依次連接的上游序列、核心序列和下游序列，其中，核心序列為：5’-[g/t]gccacaccca[a/c]-3’或5’-[g/t]tgggtgtggc[a/c]-3’，上游序列和下游序列均包括：至少三個與gc基因互補配對的堿基或至少兩個與gc基因互補配對的c或g堿基；同時，分子信標探針的長度為25-35bp，tm值為62-65℃，分子信標探針的5’端和3’端分別用熒光報告基團和熒光淬滅基團標記。

該分子信標探針的核苷酸序列覆蓋gc基因的rs7041和rs4588兩個snps位點，僅需要qpcr儀和一條熒光標記的分子信標探針，即可實現對大量樣品的gc基因中兩個重要多態性位點的分析，加上qpcr儀運行成本和操作技術要求相對較低，這就大大降低了檢測成本和分析難度。

具體地，該分子信標探針的長度為25-35bp。分子信標探針是一種可形成發夾結構的寡核苷酸探針，本發明實施例中，“環”一般長15-30個核苷酸，是與目標序列互補的探針主體，tm值比qpcr的退火溫度高7-10℃，如推薦ta＝55℃，探針的tm便在62-65℃；“莖”一般長5-7對核苷酸，可部分或全部由人為加入的堿基形成，cg堿基含量占75-100％，以使“莖”的tm比qpcr的ta高7-10℃，熒光分子一端不宜緊接g堿基，避免后者的熒光淬滅作用。

該分子信標探針核心序列包含一段兩個snps(rs7041和rs4588)之間的dna片段(10bp)，再通過人工設計上有序列和下游序列，形成莖環結構。具體地，在本發明一優選實施例中，分子信標探針的核苷酸序列為：

seqidno:1：cacagctgatgccacacccaaggaactgtg；或

seqidno:2：cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg；或

seqidno:3：ctggtctgatgccacacccaaggaaccga。

具體地，分子信標探針的5’端標記的熒光報告基團為fam、hex、tet、vic、rox、cy5、cy3、joe、alex和cal中的至少一種；分子信標探針的3’端標記的熒光淬滅基團為dabcyl、bhq、eclipse和tamra中的至少一種。

另一方面，本發明實施例提供了一組用于檢測gc基因snps位點的分子信標探針和引物對，該分子信標探針為上述分子信標探針，且該引物對包括第一引物和第二引物，第一引物和第二引物的長度均為20-30bp；且第一引物包含5’-ggcagagcg-3’，第二引物包含5’-ggaggc-3’或5’-gaggt-3’。

具體地，在本發明一優選實施例中，第一引物與分子信標探針在同一鏈上，且第一引物的tm值為62-65℃，第二引物的tm值為58-60℃。一優選實施例中，第一引物為：seqidno:4：ggtttttcagactggcagagcgacta；

第二引物為：seqidno:5：gaggtgagtttatggaacagca。

又一方面，本發明實施例提供一種用于檢測gc基因snps位點的試劑盒，包括本發明實施例的分子信標探針和引物對，還包括taqhs酶、dntps、pcr緩沖液。該用于檢測gc基因snps位點的試劑盒，因含有本發明特有的分子信標探針和引物對，所以具有高效、靈敏、特異性強的特點，而且該試劑盒成本低、使用方便，僅需要qpcr儀可實現對大量樣品的gc基因中兩個重要多態性位點的分析。

最后，本發明實施例提供一種gc基因snps位點的檢測方法，包括如下步驟：

提取dna樣本；

將上述dna樣本與本發明實施例的試劑盒配成pcr反應體系，進行pcr擴增；

根據擴增結果分析樣本中gc基因snps位點。

該gc基因snps位點的檢測方法，因使用本發明實施例特有的試劑盒，根據熒光信號在熔解曲線程序中出現的峰型判斷gc不同的基因型，因此檢測步驟簡單、耗時少、成本低的特點。

具體地，上述pcr擴增為降落pcr擴增。

具體地，上述dna樣本為人全血dna樣本。

本發明先后進行過多次試驗，現舉一部分試驗結果作為參考對發明進行進一步詳細描述，下面結合具體實施例進行詳細說明。本說明書中的英文縮寫的全稱和中文內容對應如下：

1)25ohd：25羥維生素d，25-hydroxyvitamind

2)asp：天冬氨酸，asparticacid

3)dab：二甲氨基偶氮苯甲酰(一種熒光淬滅劑)，dabsyl

4)fam：羧基熒光素，carboxyfluorescein

5)gc：種群特異性成分/維生素d結合蛋白，group-specificcomponent/vitamindbindingprotein。斜體表示其基因。

6)glu：谷氨酸，glutamicacid

7)kasp：等位基因特異性競爭pcr基因分型法，kbiosciencescompetitiveallele‐specificpcrgenotypingsystem

8)lys：賴氨酸，lysine

9)ncbi：美國國立生物技術信息中心，nationalcenterforbiotechnologyinformation

10)pcr：聚合酶鏈式反應，polymerasechainreaction

11)qpcr：定量pcr，quantitativepolymerasechainreaction

12)rflp：限制性酶切片段長度多態性，restrictionfragmentlengthpolymorphism

13)snp(s)：單核苷酸多態性位點，singlenucleotidepolymorphism(s)

14)thr：蘇氨酸，threonine

15)ta：退火溫度，annealingtemperature

16)tm：熔解溫度，meltingtemperature。

實施例1分子信標探針及引物對設計

1)獲得目標snps基本信息

從美國國立生物技術信息中心(ncbi)網站的snp數據庫查詢gc基因的rs7041和rs4588這兩個snps位點信息，結果如下：

rs7041[homosapiens]：agcgactaaaagcaaaattgcctga[g/t]gccacacccacggaactggcaaagc

rs4588[homosapiens]：gcaaaattgcctgatgccacaccca[a/c/t]ggaactggcaaagctggttaacaag

然后在geneview鏈接的dbsnp數據庫中核查這兩個snps。rs7041確認為[g/t]二態性，rs4588確認為[a/c]二態性，與文獻報道一致。rs4588的t堿基可能極其罕見，根據后續設計的探針，t將被合并計入a或c的情況。然后再在ncbi的gene數據庫查詢人類gc基因信息(geneid：2638)，并鏈接至dna序列(refseqgene：ng_012837.2)。通過序列比對，將以上兩個snps定位到dna，確定一段這兩個snps居中的dna片段(如下所示)，用于后續的引物和探針設計，兩個snps間隔10bp，使一條探針覆蓋這兩個snps成為可能。

2)探針與引物設計

分子信標探針和引物的設計總結為以下法則：

①“環”一般長15-30個核苷酸，是與目標序列互補的探針主體，tm值比qpcr的退火溫度(ta)高7-10℃，如推薦ta＝55℃，探針的tm便在62-65℃；

②探針的兩端到臨近snp的核苷酸序列中應至少有3個堿基能與目的dna片段完全互補(即snp不應在靠近探針兩端的3個堿基范圍內)，或至少2個c或g堿基與目的dna序列互補，以保證待測位點與探針不互補時，探針兩端有一定的結合能力；

③“莖”一般長5-7對核苷酸，可部分或全部由人為加入的堿基形成，cg堿基含量占75-100％，以使“莖”的tm比qpcr的ta高7-10℃，熒光分子一端不宜緊接g堿基，避免后者的熒光淬滅作用；

④5’末端標記熒光分子，3’末端標記淬滅分子；

⑤整個分子信標探針全長一般25-35個核苷酸，不能與引物形成可以引發擴增的穩定二聚體，且探針和引物與目的dna的互補結合區域沒有重疊部分；

⑥引物擴增目的dna片段的產物長度宜在200bp以內，最好短于150bp；

⑦對應于同一條dna單鏈上的引物和探針具有相近的tm值，且高于另一條引物tm值的5-8℃；

⑧引物符合上述要求外，再符合其余的引物設計常規法則。

其中，⑤⑥⑦三條法則連同后文qpcr反應體系(見后文表5)中提高探針及其互補鏈引物濃度(即：提高探針互補鏈產量的非對稱pcr)的策略，都有助于增強探針與目標鏈結合的競爭優勢。根據這些條件，以gc蛋白質編碼的正義dna鏈為模板，同時覆蓋rs7041和rs4588兩個snps的候選探針信息可能的探針序列如表1。類似地，也可根據正義鏈的互補dna鏈為模板設計探針。

表1

¹pta1-5、ptc1-2和pgc1分別對應的單倍體型為t-a、t-c和g-c。

²下劃線堿基為snps，方框內堿基為發夾結構。

³以tmutilityv1.3軟件計算的tm值，條件為：探針0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm。

⁴以primerexpress3.0、dnafoldingform等軟件的分析發現。

遵循上述原則，以primerpremier5軟件在第一個snp上游100bp范圍內設計上游引物，在第二個snp下游100bp范圍內設計下游引物，引物長度預設(25±5)bp，產物長度預設80-150bp，搜索嚴格程度從“非常高(veryhigh)”開始，其余參數為默認值，沒有符合條件的引物對；然后搜索嚴格程度設為“高(high)”，出現10對引物。表2列出了ta值最接近55℃的一對引物及產物評分高過此對引物擴增產物評分的全部引物對。

表2

¹以rs7041上游100bp的堿基為1開始計算位置，后同。

²以tmutilityv1.3軟件計算的tm值，條件為：引物0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm。

以在線軟件ncbiprimer-blast和primer3在rs7041上游100bp范圍內搜索上游引物、在rs4588下游100bp范圍內搜索下游引物，參數設置均為默認，對更多引物的位置做擴展檢索。表3列出了候選引物群的代表性序列。

表3

¹粗體下劃線字母代表同一引物群在共有位置上的片段。上游引物群i的共同片段也存在于表2；下游引物群ii與表2中的下游引物也具有共同片段。

²共同位置片段位于中部的其余引物未再列出。

可見，rs7041上游100bp的適宜引物都具有一段長9bp的共同位置5’-ggcagagcg-3’；rs4588下游100bp的適宜引物有兩群，一群具有6bp的共同位置5’-ggaggc-3’，另一群具有8bp的共同位置5’-gaggaggt-3’。

3)最佳探針與引物的理論篩選

以primerexpress3.0的引物探針測試工具(primerprobetesttool)對上述引物對和探針進行分析，從自身發夾(hairpin)、自身二聚體(selfdimers)和交叉二聚體(crossdimers)的形成情況濾除欠佳的組合，保留f1-r3和f3-r4兩對引物(表2中的粗體字)。在qpcr的ta為55℃及體系組分構成的條件下，探針同鏈的(上游)引物tm宜在62-65℃之間，探針互補鏈的(下游)引物tm宜在58-60℃之間，并且不能與探針形成可以擴增的二聚體，因此，初步考慮f3與r3組成引物對，并進一步手動調整和評估。滿足條件的上游引物命名為gc-f(seqidno:4：ggtttttcagactggcagagcgacta)、下游引物記為gc-r(seqidno:5：gaggtgagtttatggaacagca)，見表4。由于一條熒光探針的價格大約在900-1200元，因此，更需對其事先做好理論分析，挑選最優的一條合成。

對表1中pta1、pta2和ptc1三條待進一步評估的探針，在其末端加入可以形成發夾結構的適當堿基，利用在線分析工具dnafoldingform(http://unafold.rna.albany.edu/)進行“莖環”結構的質量評估。在特定熔解曲線分析條件下，分子構象合理而穩定(自由能差值dg<0)的分子信標探針，其預測的二級結構主要滿足以下條件：①有正確的“莖”結構，保證熒光分子和淬滅分子空間靠近；②不宜出現7對以上堿基互補的“莖”結構。如不滿足上述條件，需調整探針位置或/和構成“莖”的堿基。

本發明擬用熔解曲線分析的ta為40℃、na⁺50mm、mg²⁺2mm，該條件下，以pta1、pta2或ptc1為“環”主體的分子信標探針的合理而穩定的二級結構如下(小寫字母為人為加入的堿基)：

三種分子信標探針對應的核苷酸序列如下：

seqidno:1：cacagctgatgccacacccaaggaactgtg；

seqidno:2：cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg；

seqidno:3：ctggtctgatgccacacccaaggaaccga。

可見，pta1(seqidno:1)、pta2(seqidno:2)和ptc1(seqidno:3)三者均可能構成有效的分子信標探針。本發明隨機選了pta1送公司合成，并在5’端連接fam熒光分子，3’端連接dab熒光淬滅分子，命名為gc-p，見表4。

表4

¹粗體下劃線是與表2、表3中上游或下游引物具有相同位置的片段，中括號內堿基為snps，小寫字母為手動加入、構成“莖”結構的堿基。

²以tmutilityv1.3軟件計算的tm值，條件為：oligo0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm。gc-p的tm計算不含兩端手動加入的堿基(小寫字母)。

³探針5’端連接fam熒光分子，3’端連接dab熒光淬滅分子；該探針與上游引物對應于同一條dna鏈。互補序列為23bp，全長30bp。

經過上述篩選得到的引物和探針對應于qpcr擴增片段(123bp)的位置如下：qpcr擴增產物全長123bp。灰色涂抹的堿基為上游引物序列和下游引物反向互補序列，方框內的堿基為探針部分序列，中括號內的堿基為多態性位點。

此外，表1-表3中的全部引物(或其互補序列)和探針(或其互補序列)也可通過適當組合、評估，人工增減堿基，以達到本發明的目的，這里不再一一分析、驗證，具體地，凡是具有表4中相同性能的引物和探針都在本發明保護范圍內。

實施例2gc基因snps位點檢測

1)dna樣本制備：根據全血dna提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司的全血dna提取試劑盒，貨號dp318-03)的操作說明提取待檢測的dna樣品，用微量分光光度計(ge公司的nanovueplus)檢測樣本在280nm和260nm波長下的比值，由此吸光度值計算的dna濃度。

2)qpcr實驗測試引物和探針：按表5中的qpcr成分配制反應試劑，并按表6的qpcr反應程序進行預實驗。三個優選條件：①熱啟動dna聚合酶，確保引物、探針分別與互補鏈雜交的特異性；②非對稱產物擴增，提高一側引物濃度以提高分子信標探針互補鏈的產量。③降落pcr(touch-down)程序提高擴增的特異性。本實驗的qpcr儀為roche480ii，同時檢測rs7041和rs4588組成的6種基因型，熒光信號檢測波長為465-510nm，圖1為roche480iiqpcr軟件生成的熔解曲線峰原始圖：圖中包含6種基因型的熒光曲線：1：gc-1s/1s；2：gc-1f/1f；3：gc-2/2；4：gc-1s/1f；5：gc-1s/2；6：gc-1f/2；橫坐標為溫度，縱坐標為檢測到的熒光信號相對值。圖2為原始數據處理的結果圖。從圖1和圖2可知，本實施例的gc基因snps位點檢測方法，只需要根據熒光信號在熔解曲線程序中出現的峰型，即可判斷gc的基因型是哪一種(見表7，基因型判斷表：rs7041和rs4588的3種單倍體基因型及其組合的6種二倍體基因型)。因此，整個檢測過程步驟簡單、耗時少、成本低，在臨床與預防醫學的分子流行病學相關工作中非常實用。

表5

¹taq熱啟動酶(takarataqtmhotstartversion)試劑盒，貨號r007a，takara(大連)公司，含：takarataqhs酶、10×pcrbuffer(mg²⁺plus)和dntpmixture(各2.5mm)。

²分子信標探針與上游引物對應于同一條dna鏈上，分子信標探針濃度和下游引物的用量高于上游引物，確保在與下游引物pcr產物互補結合過程中，探針比上游引物pcr產物更具競爭優勢。

表6

¹表中各中文名詞對應于roche480iiqpcr操作軟件的英文依次如下：程序名稱(programname)；分析模式(analysismode)；循環數(cycles)；目標溫度(target)；時間(hold)；斜率(ramprate)；第二目標溫度(sectarget)；步長(stepsize)；信號采集次數(acquisitions)；采集模式(acquisitionmode)；預變性(pre-incubation)；無(none)；降落pcr(touch-down)；擴增(amplification)；定量(quantification)；單次(single)；熔解曲線(meltingcurve)；連續(continuous)；冷卻(cooling)。

²儀器設置：檢測模式(detectionformat)為多色探針(multicolorhydro-probe)；定制(customize)：熒光(fluos,465-510)；模塊規格(blocksize)：96孔；反應體積(reactionvolume)：25μl。

³表格中的“—”表示無需設置。

⁴連續監測40-80℃升溫區間的熒光信號，分子信標探針從發夾結構打開，并結合到互補dna鏈上，熒光信號達到最大值。隨著溫度升高，有錯配的探針-dna雜交鏈會在較低溫度下解鏈，形成熔解曲線峰值；而匹配程度高的探針-dna雜交鏈會在較高溫度下解鏈。

表7

3)將pcr產物送往商業服務公司進行測序，以驗證分子信標qpcr的分型結果。測序結果如圖3所示，6種基因型的樣品各3個測序的結果與本發明技術分析的結果一致，圖3將6種基因型的結果各列舉了一例。

4)大量樣本檢測：按照上述預實驗成功的實驗條件，進行大量樣本的基因分型檢測，檢測結果如圖4所示。

在研究gc基因與人群多種慢性病的關系時，分析rs7041和rs4588兩個snps構成的gc-1f、gc-1s和gc-2基因型是一項重要內容。利用我們發明的這種方法，我們曾從某市人群流行病學研究中納入分析了1906名18-83歲成年女性gc-1f、gc-1s和gc-2基因型的頻率差異。rs7041和rs4588兩個snps基因型分布的hardy-weinberg平衡檢驗證實樣本具有良好代表性。表8顯示了不同血漿25ohd濃度下gc的6種基因型頻率：gc-2/2和1f/2的基因型頻率隨著血漿25ohd濃度的升高而下降(p<0.05)；gc-1s/1s和1s/1f的基因型頻率卻隨著血漿25ohd濃度升高而升高(p<0.05)。表9顯示了不同年齡段、不同血漿25ohd濃度下gc的3種等位基因型頻率：gc-2等位基因型的頻率隨著血漿25ohd濃度的升高而下降(p<0.05)；gc-1s等位基因型的頻率卻隨著血漿25ohd濃度升高而升高(p<0.05)。這就提示，gc-2等位基因型是維生素d缺乏的危險因素，而gc-1s等位基因型是保護因素。已知gc-2與較低的血循環gc蛋白濃度相關，且與維生素d及其代謝產物的結合能力低于gc-1f和1s。因而，gc-2通常導致血循環較低的25ohd濃度。本發明方法檢測到的這組人群的結果與此前研究一致，也說明該方法在應用上有效。

表8

¹以血漿25ohd(nmol/l)為判斷標準，缺乏：-<50；不足：50-<75；充足：≥75。

表9

¹以血漿25ohd(nmol/l)為判斷標準，缺乏：-<50；不足：50-<75；充足：≥75。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>深圳市慢性病防治中心

<120>分子信標探針及引物對、gc基因snps位點檢測方法

<160>5

<170>patentinversion3.3

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<213>人工合成

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