一種免疫原性強的血清2型豬鏈球菌及其應用的制作方法

本發明屬于獸醫生物制品技術領域，具體涉及一種免疫原性強的血清2型豬鏈球菌及其應用。

背景技術：

豬鏈球菌(streptococcussuis,ss)是一種世界性的可引起豬重大疾病的重要病原菌之一，同時它也是一種人獸共患病病原體。人感染豬鏈球菌的途徑主要是接觸病死豬，致病菌經破損皮膚和黏膜侵入，或食入未煮熟的病死豬肉而感染。近年來，人感染豬鏈球菌的報道大量增加，而這些病例主要來自亞洲國家。我國于2005年在四川省爆發的豬鏈球菌疫情共感染215人，病死率將近20％。

目前公認的豬鏈球菌的血清型有33種(1-31，33，1/2)，經流行病學分析，臨床上豬鏈球菌主要以2、7、9型是引起豬感染的重要流行血清型，血清2型致病力最強，極易引起人的感染和死亡。

由于臨床中常大量不合理使用抗生素來控制細菌性疾病，致使豬場的細菌在抗生素的壓力下進化出耐藥菌群。因此，用藥物防控豬鏈球菌的難度越來越大，而且隨著人們對食品安全問題的重視，抗生素在動物疫病防控中的應用會越來越少，疫病的防控更多的會依賴疫苗。豬鏈球菌血清型眾多，且不同血清型之間的毒力和致病力差異較大，各血清型之間的交叉保護很低，所以，目前已有的商品化疫苗均不能對該病提供完全的免疫保護。因此，篩選免疫原性強并具有交叉保護力的豬鏈球菌通用菌株，是制備高效的豬鏈球菌疫苗的關鍵所在。

技術實現要素：

本發明的目的在于一種免疫原性強的血清2型豬鏈球菌及其應用。

本發明所采取的技術方案是：

一種豬鏈球菌，該豬鏈球菌的保藏編號為gdmccno：60188，記名為豬鏈球菌gdzq株。

本發明提供的豬鏈球菌gdzq株，于2017年05月17日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所)，保藏號為：gdmccno：60188，保藏中心建議的分類命名為streptococcusporcinus。保藏中心于2017年05月18日鑒定菌株是存活的。

上述豬鏈球菌在制備防控豬鏈球菌病的藥物中的應用。

優選的，所述的藥物為疫苗。

一種疫苗，是用上述所述的豬鏈球菌作為抗原制備的。

優選的，所述的疫苗為滅活疫苗。

優選的，所述疫苗中的佐劑為鋁膠。

優選的，所述的疫苗為單價疫苗。

優選的，所述的豬鏈球菌的含量為1×10⁸～3×10¹²cfu/ml。

本發明的有益效果是：

本發明申請人從160多株菌株中篩選出一株血清2型豬鏈球菌，記名為豬鏈球菌gdzq株，其毒力較強，5×10⁸cfu即可引起全部試驗仔豬死亡；免疫原性強，疫苗抗原含量僅需1×10⁸cfu即可對試驗仔豬產生100％的免疫保護，優于目前市面上的同類產品。此外豬鏈球菌gdzq具有較好的交叉保護力，能保護豬免受目前國內主要的流行血清2、7、9型豬鏈球菌的侵害。

利用本發明篩選出的豬鏈球菌gdzq制備豬鏈球菌疫苗，工藝簡單，僅需單獨培養豬鏈球菌gdzq，經常規處理即可制備得到豬鏈球菌疫苗。本發明技術工藝簡單，成本低廉，可以克服目前市場上多價豬鏈球菌疫苗生產中工藝繁瑣的缺陷。

本發明克服現有技術的不足，提供了預防豬豬鏈球菌病的單價疫苗，可以彌補市場的空白。所述單價疫苗具有較好的交叉保護力，利用其對豬進行免疫接種，可以抵御國內主要的豬鏈球菌流行血清型2、7、9型菌株的侵害，市場前景廣闊。

附圖說明

圖1為血平板培養結果；

圖2為革蘭氏染色結果；

圖3為豬鏈球菌pcr鑒定結果；

圖4為豬鏈球菌血清型分型結果。

具體實施方式

實施例1豬鏈球菌gdzq株的分離、鑒定和毒力試驗

一、豬鏈球菌菌株的分離和篩選

1、豬鏈球菌菌株的分離

2015年于廣東肇慶某豬鏈球菌發病豬場采集病料，無菌取發病豬的腦組織，接種到tha瓊脂培養基上，置37℃培養24～36h后挑選典型的單個菌落進行純化培養。挑選純化好的單菌落接種于thb液體培養液中，37℃搖床(220r/min)培養過夜。純培養物接種含綿羊血的瓊脂平板，37℃培養24h后，可見形成直徑1～2mm透明，圓潤的菌落，在血平板中呈β溶血(圖1)。挑取上述單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察，可見藍紫色，卵圓形或圓形，成雙或成鏈狀的菌落分布于視野中(圖2)，初步判斷為鏈球菌。

2、豬鏈球菌菌株的篩選

對初步證實是豬鏈球菌菌株的160多株菌株進行篩選。經毒力、生長特性等的比對驗證，最終篩選出易于培養、毒力較強的豬鏈球菌1株，進行如下研究。

二、豬鏈球菌菌株的16srrna鑒定

對毒力最強的豬鏈球菌菌株進行16srrnapcr鑒定，引物序列如下：

p1：5’-cagtatttaccgcatggtagatat-3’(seqidno:1)；

p2：5’-gtaagataccgtcaagtgagaa-3’(seqidno:2)。

經pcr檢測可疑菌落擴增出大小約為294bp的特異性條帶(圖3)，pcr產物送上海生工生物公司進行序列測定，測序結果與ncbigenbank中已有序列比對，比對結果顯示，分離到的菌株為豬鏈球菌。將菌株命名為gdzq株。

三、豬鏈球菌gdzq株的血清型鑒定

1凝集試驗

將上述鑒定為豬鏈球菌的菌株gdzq進行血清凝集試驗，取10l標準陽性血清于玻片上，取10l純化的豬鏈球菌菌液充分混勻，輕輕搖動3分鐘，日光燈下觀察結果，若有顆粒狀物質出現，則為陽性；若為均勻混懸液，則為陰性。經鑒定豬鏈球菌gdzq株為血清型2型。

2pcr定型

用pcr方法對菌株gdzq株進行血清型定型。定型引物為：

cps2i-f：ttcgtattaacttacttggcgt(seqidno:3)；

cps2i-r：taaatccccatatgccaaatcc(seqidno:4)。

pcr的結果顯示gdzq株為血清型2型，見圖4。

四、.豬鏈球菌gdzq株的致病力研究

取20頭15日齡仔豬隨機分成a、b、c、d四組，每組5頭，進行豬鏈球菌攻毒，劑量及分組如表1。

表1豬鏈球菌gdzq株攻毒結果

每頭豬分別頸部肌肉注射，每天觀察仔豬發病情況，連續觀察10天。試驗結果顯示，a、b、c所有試驗仔豬于攻毒后48h均開始表現出臥地不起，食欲廢絕，呼吸困難，呼吸羅音，并出現抽搐，四肢劃水狀等一系列神經癥狀，d組有3頭仔豬于攻毒后4天出現上述癥狀，對照組仔豬正常。試驗證實，豬鏈球菌gdzq株對仔豬有較強的致病力。

實施例2豬鏈球菌疫苗的制備以及免疫效力檢測

一、豬鏈球菌疫苗的制備

通過以下步驟制備疫苗：

1)一級種子液制備：取凍干保存的豬鏈球菌gdzq株接種于tsa固體平板，在溫度為37℃的條件下培養18h；然后挑取單菌落于tsb培養基(含5％新生牛血清)中，在溫度為37℃的條件下，以轉速120rpm振蕩培養18h，進行純粹檢驗合格后，作為一級種子液，置2～8℃保存備用，保存時間均不超過3天。

2)二級種子液制備：取步驟1)得到的一級種子液，按種子液與培養基的體積比1:20接種于tsb培養基中，在溫度為37℃的條件下，以轉速120rpm振蕩培養16h，進行純粹檢驗合格后，作為二級種子液，置2～8℃保存備用，保存時間均不超過3天。

3)原菌液制備：取步驟2)得到的二級種子培養液，按種子液與培養基的體積比1:100接種于tsb培養基中，在溫度為37℃的條件下，以轉速120rpm振蕩培養24h后，得到原菌液。

4)活菌計數：將步驟3)中獲得的菌液進行活菌計數，步驟如下：

取豬鏈球菌gdzq株菌液1ml，用ph7.4pbs做10倍系列稀釋，每個稀釋度換1支吸管。具體方法是：準確吸取菌液100μl，放入盛有稀釋液900μl的第一支1.5ml離心管中(不接觸液面)，另取1支1ml槍頭將第一管液體混合均勻后，吸取100μl放入盛有稀釋液900μl的第2支1.5ml離心管中，依次稀釋至最后1管。根據對樣品含菌數的估計，選擇適宜稀釋度，吸取最終稀釋度的菌液接種適宜的培養基平板3個，每個滴100μl，使菌液散開，置37℃涼干后，翻轉平板，培養48～72h，按照下列方法數出每個平皿中的菌落個數，計算每ml菌液中的活菌數(cfu/ml)。

5)滅活：在上述步驟3)制備的菌液中加入終濃度為0.2～0.4％的甲醛溶液，37℃振蕩滅活24h。

6)乳化：在步驟5)得到的滅活菌液中取樣，按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進行純粹檢驗；將原菌液在轉速為8000rpm的條件下無菌離心10min取沉淀的菌體，用無菌生理鹽水重懸菌體后洗滌，經洗滌的菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為2×10⁸cfu/ml的制苗菌液，將制苗菌液與鋁膠佐劑以體積比4：1～9:1混合，轉速8000rpm的條件下乳化20min，得到治療豬鏈球菌病的疫苗，2～8℃保存備用。

二、豬鏈球菌疫苗的免疫效力檢測

1.最小免疫效力試驗

取25頭15日齡仔豬，隨機分成a、b、c、d、e共5組，每組5頭，其中a組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，0.5ml/頭，14天后二免，0.5ml/頭；b組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，1ml/頭，14天后二免，1ml/頭；c組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭；d組頸部肌肉注射市售豬鏈球菌商品疫苗，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭；e組仔豬分別注射生理鹽水，2ml/頭。所有實驗組在二免14天后分別用豬鏈球菌血清2型菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭，連續觀察10天，觀察記錄仔豬發病和死亡情況，計算每組保護率，如表2所示。

表2豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗對仔豬的免疫保護結果

表2結果顯示，豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗對仔豬能產生較好的免疫保護效力，免疫0.5ml，1ml、2ml組的保護率均為100％，即疫苗的抗原含量為1×10⁸cfu可對仔豬形成較好的免疫保護，商品疫苗免疫組有40％仔豬發病，攻毒對照組仔豬100％發病。

2.交叉保護試驗

取30頭15日齡仔豬，隨機分成a、b、c、d、e、f6組，每組5頭，其中a、b、c組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭；d、e、f組仔豬頸部肌肉注射生理鹽水，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭。a、d組在二免14天后分別用2型標準菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭；b、e組在二免14天后分別用7型菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭；c、f組在二免14天后分別用9型菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭，連續觀察10天，觀察記錄仔豬發病和死亡情況，計算每組保護率，如表3所示。

表3豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗對仔豬的交叉保護結果

表3結果顯示，豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗可對2、7、9型菌株的攻毒分別產生100％的交叉免疫保護。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

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<110>廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司，四川海林格生物制藥有限公司

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