用于人類KRAS基因突變檢測的試劑盒及其檢測方法與流程

本發明涉及生物技術和醫學領域，尤其涉及的是一種用于人類kras基因突變檢測的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：目前，肺癌己成為全球癌癥死亡的首要原因，全球每年新發病例150萬，嚴重威脅人類健康。在肺癌患者中，非小細胞肺癌約(nsclc)占80％，且就診時80％己失去手術或放射治療最佳機會，致使其長期生存率低，療效令人堪憂。iiib/iv期非小細胞肺癌2年生存率僅10％-20％，中位生存時間僅10-12月。因此，人們需要不斷研究新的治療方法以提高肺癌治療的有效率，其中以分子靶向治療為代表的新治療方法，為晚期nsclc的治療帶來了新的希望。ras基因家族與人類腫瘤相關的基因有三種——h-ras、k-ras和n-ras，分別定位在11、12和1號染色體上。k-ras因編碼21kd的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，k-ras對人類癌癥影響最大，它好像分子開關：當正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則導致細胞持續生長，并阻止細胞自我毀滅。她參與細胞內的信號傳遞，當k-ras基因突變時，該基因永久活化，不能產生正常的ras蛋白，使細胞內信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。k-ras基因就像體內一個“開關”，它在腫瘤細胞生長以及血管生成等過程的信號傳導通路中起著重要調控作用，正常的k-ras基因可抑制腫瘤細胞生長，而一旦發生突變，它就會持續刺激細胞生長，打亂生長規律，從而導致腫瘤的發生。k-ras基因檢測是目前醫生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法。看k-ras基因有沒有突變，可以篩選出抗egfr(表皮生長因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實現腫瘤病人的個體化治療，從而延長患者生存期。對于沒有突變的患者，則能減少不必要的治療費用和毒副作用。目前在歐美，k-ras檢測已成為大腸癌患者內科治療前必做的常規檢查。突變擴增阻滯系統(amplificationrefractorymutationsystem，arms)也叫等位基因特異性pcr，該法是在pcr基礎上發展而成的，是一種直接用于點突變分析的pcr技術。其依據的基本原理是taqdna聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此對于3′末端錯配的引物以低于正常末端配對引物的速度延伸，當錯配堿基的數目達到一定程度或者條件達到一定的嚴謹程度時，擴增反應終止。大部分腫瘤的突變都是體細胞突變，突變細胞往往與野生型細胞混雜在一起。因此所提取的dna常帶有大量野生型dna，所以對體細胞突變檢測需要較高的特異性，而目前廣泛使用的直接測序法檢測能力有限，不能完全滿足臨床需要。特異性探針法如以scorpionsarms為代表的英國dxs和中國廈門adx的kras檢測試劑盒雖然檢測靈敏度高，但其檢測費用較高，不適合國內nsclc患者的常規檢測和篩查，因此，臨床迫切需要開發一種快速準確、操作簡便、靈敏度高的檢測kras基因突變的試劑盒，滿足臨床用藥和檢測診斷的時效性要求。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種高靈敏度的用于人類kras基因突變檢測的試劑盒和反應體系，本發明的另一目的是提供一種用于檢測kras基因突變的檢測方法。本發明是通過以下技術方案實現的：用于人類kras基因突變檢測的試劑盒，其特征在于：包括7種基因的特異性引物對和7條與特異性引物配合使用的探針引物，所述的特異性引物對和探針引物為：優選的，還包括質控系統或/和內控系統，所述的質控系統為一對質控引物和相應的質控探針，所述的內控系統為一對內控引物和相應的內控探針，具體如下：質控引物：上游引物：5’aatataaacttgtggtagttgga3’下游引物：5’ttcgtccacaaaatgattctga3’質控探針：5’ctgtatcgtcaaggcactctt3’；內控引物：上游引物：5’cccagcagtttggccc3’下游引物：5’tccttaatgtcacgcacgat3’內控探針：5’accaccacggccgagcgg3’。優選的，所述的試劑盒還包括kraspcr反應液、酶系1、陽性對照、陰性對照和depc水。優選的，所述的試劑盒可用于血清游離dna樣本、組織樣本或穿刺樣本的kras基因突變的檢測。作為優選，包括pcr擴增試劑和對照試劑，所述的擴增試劑、對照試劑的組成成分和終濃度如下：用于人類kras基因突變的檢測方法，所述的方法包含以下步驟：(1)樣本dna的提取血清游離dna提取和組織樣本dna提取；(2)pcr反應體系的配制分別配制pcr反應液16ul，酶系1、2ul、引物探針混合液2ul，模板dna5ul，陰性對照和質控視為樣本，作相同處理；(3)結果判讀：根據熒光pcr擴增儀顯示的ct值判斷檢測結果：利用特異性引物和熒光探針進行pcr檢測，突變和質控由fam指示，內控由hex信號指示，通過計算δct的大小進行判斷，反應管的δct值＜δctcut-off值時，則樣品為該反應管對應信號突變陽性，反之則為陰性或低于試劑盒的檢測下限。δct值＝突變樣本ct值-質控ct值表cutoffδct值檢測靶點cutoffδct值12cys1012ser1012arg812val1212asp812ala1213asp10本發明提供了用于人類kras基因突變檢測的試劑盒，所述試劑盒包括pcr反應緩沖液、引物探針混合液、酶系1、陽性對照、陰性對照。引物探針混合液包含突變位點基因和內控引物探針，質控基因和內控檢測引物探針，突變和質控探針標記fam熒光素，內控標記hex熒光素，質控及內控均作為結果判讀的一部分，質控基因選擇是人類kras基因相對保守的區段，內控選擇的是人β-actin保守基因，雙控體系共同用于監控血漿樣本dna質量和pcr反應過程，與現有技術相比，本發明的有益效果是：1)高靈敏度：可在100ng野生型人類基因組背景下檢測出1％微量突變模板，減少了假陰性結果的出現；2)全封閉反應，避免假陽性結果的發生；3)雙控反應體系，質控及內源對照，有效檢測pcr擴增及核酸提取。附圖說明圖1為12cys靈敏度結果圖2為12ser靈敏度結果圖3為12arg靈敏度結果圖4為12val靈敏度結果圖5為12asp靈敏度結果圖6為12ala靈敏度結果圖7為13asp靈敏度結果圖8為臨床陽性樣本用12cys檢測結果圖9為臨床陽性樣本用12ser檢測結果圖10為臨床陽性樣本用12arg檢測結果圖11為臨床陽性樣本用12val檢測結果圖12為臨床陽性樣本用12asp檢測結果圖13為臨床陽性樣本用12ala檢測結果圖14為臨床陽性樣本用13asp檢測結果具體實施方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1利用本發明實時熒光pcr檢測kras7種基因突變的方法包括如下步驟：1、核酸提取以石蠟包埋組織為例，按照推薦的qiaampdnaffpetissuekit說明書進行石蠟包埋組織基因組dna的提取。2、pcr反應體系的配制(25ul)試劑名稱加入量pcr反應液16ul酶系12ul引物探針混合液2ul模板dna5ul所述的模板dna包含樣本dna和陰性、陽性對照dna。3、pcr擴增實時pcr擴增條件為：50℃2min，1個循環；95℃5min；95℃10s，55℃15s,72℃30s，5個循環；95℃10s，60℃45s(收集fam和hex熒光信號)，40個循環。4、結果判定1)檢測結果除陰性對照外，突變反應管的內控信號hex應有擴增曲線，且ct≤33；若ct＞33，則提示樣本dna模板量偏低或存在pcr抑制劑，需重新提取或者增加pcr模板量再做，但是如果管內fam有信號，可能是由于突變的擴增抑制了內控序列的擴增，結果仍然可信。2)質控管fam信號ct＜21，提示樣品加入量過高，需減少樣本加入量再實驗；質控管fam信號ct＞26或陰性，提示該樣本加入量過低或提取失敗，需要增加樣本量再實驗或重新提取。3)質控管fam信號21≤ct≤26a：arms引物管ct＜30，樣本結果判讀為陽性。b：arms引物管＞陰性臨界值或無擴增曲線，樣本結果判讀為陰性。c：相應arms引物管30≤ct值＜陰性臨界值(如下表)，且其與質控管fam信號的δct≤△ctcut-off值，該樣本結果判讀為陽性；反之則判讀為陰性。實施例2利用本發明檢測kras基因突變陽性患者石蠟包埋組織樣本10例，并與測序結果進行對照，結果：檢測出12val陽性4例，12asp陽性5例，13asp陽性1例，與測序法符合率100％。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12