本發明屬于以等溫擴增為代表的分子生物學檢測方法在肺炎支原體檢測方面的應用，即肺炎支原體的環介導等溫擴增檢測技術及其專用引物、檢測方法和試劑盒。
背景技術：
支原體(mycoplasma)是介于細菌與病毒之間的一種原核細胞型微生物。迄今為止，能夠導致人體感染的支原體大約有20種，其中以肺炎支原體(m.pneumoniae,mp)最為多見。mp是引起人類呼吸道感染的重要病原菌之一，每年約有10％～30％的社區獲得性肺炎是由其感染引起。mp感染呈全球性分布，它可以通過飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播，人群普遍易感。當mp侵入呼吸道后，借滑行運動定位于纖毛氈的隱窩內，以其尖端特殊結構(頂器)牢固的黏附于上皮細胞表面的受體上，抵抗黏膜纖毛的清除和吞噬細胞的吞噬，由此在呼吸道立足。除呼吸道感染外，mp還可引發嚴重的肺外并發癥，常累及中樞神經系統、心血管系統、皮膚及肝腎器官等。此外，有研究報道mp感染還是某些自身免疫病(如自身免疫性溶血性貧血)的風險因素，因此，對于臨床上疑似mp感染的患者進行早期實驗室診斷變得尤為重要。
目前支原體的實驗室診斷金標準為分離培養，但分離培養法通常存在兩個弊端，一是檢測時間過長，固體平板生長出典型菌落至少需要3周時間，對臨床快速診斷意義不大。二是分離培養難度大、要求苛刻，一般醫院和實驗室難以推廣。盡管指示細胞培養法能大大縮短分離培養所需時間，但培養過程中菌株容易死亡，亦不適用于臨床快速檢測。血清學方法在臨床上廣泛使用，盡管一些商品化試劑盒市面有售，但各試劑盒的包被抗原不同以及臨界值設定不同導致各試劑盒的特異性和敏感性存在差異。此外，血樣的采集時間和患者年齡對依賴血清學方法的實驗室診斷影響較大，而某些支原體在血清學上又存在交叉反應性。pcr的出現雖克服了傳統實驗敏感度低的弊端，但需要特殊儀器，不以普及，亦不適用于基層單位、現場監測和床旁檢測。因此，開發一種針對mp的即時檢驗方法成為了臨床和實驗室中亟待解決的問題。
環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是一種新型等溫核酸擴增技術，它具有簡便、快速、經濟、靈敏等優點，近年來發展迅速，已被廣泛應用于核酸快速檢測領域。lamp的原理是針對靶基因上6個區域設計2對引物(fip[f1c+f2]、bip[b2+b1c]、f3、b3)，在鏈置換型dna聚合酶的作用下，于等溫條件在短時間內(15～60min)進行核酸擴增。在dna擴增反應中，當一個dntp分子結合到dna鏈上時會解離下一個焦磷酸根離子，后者與鎂離子結合形成大量副產物焦磷酸鎂，反應結果無需電泳檢測，肉眼可見白色沉淀，加入熒光染料后可觀察到綠色熒光。與傳統pcr相比，lamp具有操作簡便、靈敏度高、特異性強，判定簡單，成本低廉等特點。其檢測靈敏度至少高于普通pcr2個數量級。此外，等溫擴增僅需一個水浴鍋或恒溫裝置，對設備的要求簡單，其操作過程耗時較短，可在1小時內完成。lamp反應結果的檢測不需要像普通pcr進行凝膠電泳，只需通過肉眼觀察白色渾濁或者綠色熒光即可，是一種簡便、快捷、高通量的檢測方法。
lamp在國內外已有報道其在肺炎支原體檢測方面的應用，但是迄今為止，市場上還未見用于檢測mp的lamp專用引物與試劑盒問世。因此開發一種針對mp的快速可靠的核酸檢測方法具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的主要內容是提供一種用于檢測mp的lamp檢測專用引物、檢測方法及試劑盒，該法不依賴于dna提純過程，粗提模板亦可進行等溫擴增，尤其適用于各基層單位及現場監測。
1.mp的lamp檢測專用引物
引物設計靶點為mycoplasmapneumoniam129chromosome，completegenome，ncbireferencesequencenc_000912.1
根據lamp引物設計的關鍵因素，主要包括引物末端的穩定性、gc含量、引物間的距離和二級結構對其進行篩選，最終得到的lamp引物。具體來說，為了在反應中能使f1c和b1c更加容易彎轉，可以形成雙莖環結構，引物f1c和b1c要高于其他幾條引物的tm值5℃左右。為提高核苷酸越與模板退火結合效率，每條引物最末端的六個堿基的吉普斯自由能變⊿g值<＝-4kcal/mol，f3/b3，f2/b2，lf/lb的3’末端⊿g值<＝-4kcal/mol，f1c和b1c的5’端的⊿g值<＝-4kcal/mol。對于引物的gc含量設定范圍在40～60％之間。對于引物之間的距離，從f2的5’端到b2的5’端應在120～180bp之間，從f2的5’端到f1c的3’端也就是莖環段在40～60bp之間，從f2的5’端到f3的3’端在0～20bp之間。最后要特別注意引物之間不能形成二級結構。通過以上設計原則篩選即得到最終引物如下。f35’-gtgagtgggtggcttgtg-3’；b35’-tgtggaccagtgtcagct-3’；fip5’-aacccccaccacatcattccccaagcacgagtgacggaa-3’；bip5’-ctttctgaaagcaacgccgcaa-ccccatctaacagttcagcg-3’。
2.mp的lamp檢測方法
本發明所提供的mp的lamp檢測方法，主要包括以下步驟：
[1]dna提取：采用粗提、商品化試劑盒提取dna或純化dna均可。
1)粗提：樣本不經過提純，直接煮沸10min后收集上清亦可作為lamp模板進行等溫擴增。
2)純化：可采用商品化試劑盒，或傳統酚氯仿等方法進行提取。
[2]lamp擴增
以上述提取的待測物基因組dna為模板，在專用引物的介導下進行擴增。其中，25μllamp反應體系包括：含uu、mg或mh的基因組dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜堿(betaine)，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase(購自neb公司)，引物用量為：5pmolf3和b3，40pmolfip和bip。lamp擴增條件可設定為55～67℃恒溫30～90min(推薦設置63℃60min)。
[3]結果判定
1)肉眼觀察
反應結束后，肉眼觀察產物是否渾濁。與陰性對照相比，明顯出現渾濁物的樣本為陽性，陽性產物經離心后在試管底部出現沉淀物。若無渾濁現象，則為陰性標本。
2)熒光顯色
反應結束后加入1μlsybr(1:100稀釋),在紫外光激發下觀察結果，產物呈熒光綠色表示該樣品存在支原體感染，顏色無變化表示待測樣品中不存在支原體。
3)檢測濁度
使用濁度測定儀器，可間接反應核酸擴增情況。陽性樣品的濁度隨反應時間的延長呈s型上升趨勢，濁度無變化表示待檢樣品中不存在支原體感染。根據儀器功能不同，可檢測實時濁度或終點濁度，評估反應前后濁度的變化來判斷結果。
3.mp的lamp檢測試劑盒
本發明所提供的mp的lamp檢測試劑盒，包含有上述lamp檢測的專用引物、主要試劑和反應參數，本發明具有以下優點：
[1]高特異性
4條引物對支原體靶序列的6個特異區域的識別保證了lamp擴增的高度特異性，即lamp能夠從相差僅一個核苷酸的基因標本中尋找出相應的靶序列進行擴增；
[2]高效擴增
靈敏度比普通pcr高約100倍；
[3]操作簡便
只需將待檢樣品(靶核酸)和檢測試劑置于約63℃恒溫水浴鍋中60min左右即可判斷結果；
[4]結果直觀
可通過肉眼、濁度儀判斷或添加熒光指示劑觀察結果。本發明可以在等溫條件下簡便快速(63℃60min)、高效特異地檢測到mp。該法不需要復雜儀器，為支原體的檢測提供了一個新的技術平臺，尤其適用于人群篩查，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。
具體實施方式
現以本發明技術方案為前提，列舉出詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例子。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、用于對mp進行lamp檢測的引物設計
從美國基因數據庫檢索獲得mp特異性保守靶序列(mycoplasmapneumoniam129chromosome，completegenome，ncbireferencesequencenc_000912.1)，應用在線引物設計軟件primerexplorerv5，上傳靶序列后，即可初步得到多組引物序列。根據lamp引物設計的關鍵因素，主要包括引物末端的穩定性、gc含量、引物間的距離和二級結構對其進行篩選，最終得到的lamp引物(詳見發明內容)。
實施例2、本發明mp的lamp檢測方法的建立
用實施例1獲得的用于對mp進行lamp檢測的引物對咽拭子標本進行lamp檢測，具體操作步驟如下：
[1]反應體系
采用天根細菌基因組dna提取試劑盒提取待測樣品中的核酸或煮沸10min后收集上清作為模板，在實施例1獲得的lamp專用引物的引導下進行等溫擴增。其中，25μllamp反應體系包括：含mp的基因組dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜堿(betaine)，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase(購自neb公司)，引物用量為：5pmolf3和b3，40pmolfip和bip。
[2]結果判定
反應結束后肉眼觀察產物是否渾濁。與陰性對照相比，明顯出現渾濁物的樣本為陽性，陽性產物經離心后在試管底部出現沉淀物。若無渾濁現象，則為陰性標本。亦可在反應液中添加1μl的sybrgreen(1:100稀釋)，在紫外光激發下觀察結果，產物呈熒光綠色表示該樣品存在支原體感染，顏色無變化表示待測樣品中不存在支原體感染。或利用濁度儀監測反應中的濁度變化來判斷結果，濁度上升表示待測樣品中存在mp(陽性)，濁度無變化表示待測樣品為陰性。
實施例3、制備mp的lamp檢測試劑盒
將lamp反應發生混合物即特異擴增引物(5pmolf3；5pmolb3；40pmolfip；40pmolbip)、bstdna聚合酶(8u)、2×反應緩沖液(40mmtris-hcl，ph8.8；20mmkcl；16mmmgso4；20mm(nh4)2so4；0.2％tween20；1.6mbetaine；2.8mmdntpeach)、sybrgreen和陽性對照共同包裝，得到本發明mp的lamp檢測試劑盒。