一種大豆分離蛋白基天然高分子水凝膠及其制備方法與流程

本發明屬于天然高分子材料技術領域，具體涉及一種化學交聯的天然生物大分子基水凝膠及其制備方法。

背景技術：

中國是大豆的故鄉，也是大豆制品的發源地，大豆蛋白作為一種可再生資源，具有來源廣泛，價格低廉，生物相容性好，降解性好等優點，是一種理想的天然材料。大豆分離蛋白是大豆蛋白分離純化的產物，其中蛋白質含量不低于90%，是制備大豆蛋白材料的主要原料。在目前的文獻報道中，有不少關于大豆分離蛋白材料的應用，如塑料、凝膠、膜、黏合劑以及生物醫用材料等。

水凝膠是親水性高分子形成的三維立體網絡，在水中溶脹但不溶于水。許多水凝膠可以在溫和的、生物相容的環境下形成，是一類極具前景的生物醫用高分子材料。對大豆分離蛋白來說，關于凝膠制備方法的研究由來已久，但遺憾的是，至今仍然沒有一種很好的制備大豆分離蛋白凝膠方法來改善其脆弱的力學，打破由此帶來的在應用上的極大限制。在目前制備大豆分離蛋白凝膠的方法中，熱致凝膠、冷致凝膠、高壓反應制備得到的凝膠，形成凝膠的作用力主要為疏水相互作用和氫鍵作用，因此穩定性差，力學性能很弱。與之相比，化學交聯方法得到的水凝膠穩定性強，力學性能也有所提升。目前已報道的大豆分離蛋白化學交聯制備水凝膠的文獻中，已經使用的交聯劑有有機分子醛類（如戊二醛等）、生物活性酶（如轉谷氨酰胺酶等）、以及天然交聯劑京尼平等。這些方法制備得到的水凝膠力學性能有了一定提升，但仍舊不能滿足應用需要。比如，固含量8wt%的大豆分離蛋白溶液，使用戊二醛交聯法，得到的凝膠儲能模量只有1.7kpa左右；而對于酶交聯和京尼平交聯得到的水凝膠，其儲能模量均在1.0kpa以下。此外，以上凝膠的制備方法還存在以下兩方面問題：一方面，有機分子的殘留會使水凝膠具有一定的細胞毒性，限制了其在生物醫用領域的應用；另一方面，大部分凝膠制備方法中，需要對大豆分離蛋白進行乙酰化、高溫加熱等預處理，并且形成凝膠的時間在幾個小時以上，這使得大豆分離蛋白凝膠的制備過程變得更加繁瑣和復雜。因而，如何在不影響大豆分離蛋白結構和保證其天然高分子性質的前提下，能夠通過簡單、快捷的方法制備力學性能好，同時具有良好生物相容性的大豆分離蛋白水凝膠仍然是有待解決的問題。

本發明克服大豆分離蛋白水凝膠力學性能弱的缺點，提供了一種具有可調力學性能，特別是具有優良彈性的大豆分離蛋白基水凝膠及其制備方法。本發明是在常溫下將大豆分離蛋白和氧化葡聚糖水溶液進行混合，然后靜置一段時間，即可制備成水凝膠。其反應機理是氧化葡聚糖可以作為大分子交聯劑，通過其含有的醛基和大豆分離蛋白分子上的官能團進行反應，起到化學交聯的作用。通過調節體系ph，可以有效調控凝膠時間和凝膠強度。相比已見報道的大豆蛋白基水凝膠，本發明制備的大豆分離蛋白基水凝膠力學性能得到了極大提升，并表現出超強的彈性。壓縮測試結果顯示，該大豆蛋白基天然高分子水凝膠最大可承受90%的壓縮形變，其壓縮強度可達400kpa；多個配比的水凝膠在壓縮形變到達80%時水凝膠仍可呈現幾乎完全的回彈性。細胞實驗顯示，該大豆蛋白基天然高分子水凝膠具有良好的生物相容性。此外，如果在制備過程中，在大豆分離蛋白水溶液中添加功能性無機納米粒子（如金納米團簇、金納米顆粒等），以及抗癌或抗生藥物分子（如鹽酸阿霉素、阿莫西林等），可以使獲得的大豆蛋白基天然高分子水凝膠具有熒光成像、光熱轉換、藥物緩釋、抗癌、抑菌等性能，可用于食品加工、生物傳感、生物醫藥及納米功能材料等領域。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服大豆分離蛋白水凝膠力學性能弱的缺點，提供一種具有可調力學性能，特別是具有較高強度和優良彈性的大豆分離蛋白基水凝膠及其制備方法。

本發明提供的高強度、高彈性的大豆蛋白基天然高分子水凝膠的制備方法，具體步驟為：

（1）制備大豆分離蛋白水溶液和氧化葡聚糖水溶液，使其最終濃度均為5-12wt%；

（2）在步驟（1）所制得的大豆分離蛋白溶液中加入氫氧化鈉水溶液，調節其ph在7.0-12.0范圍內；

（3）在步驟（2）所得的大豆分離蛋白溶液中加入氧化葡聚糖水溶液，混勻靜置0.1-120min，即得到大豆蛋白基天然高分子水凝膠；

本發明中，所述的大豆分離蛋白水溶液可以由市售的大豆分離蛋白經氫鍵破壞劑（如鹽酸胍）和二硫鍵破壞劑（如二硫蘇糖醇）處理后，再透析除去氫鍵破壞劑和二硫鍵破壞劑后獲得，也可由其他方法制備獲得。

本發明中，所采用的氧化葡聚糖可以由葡聚糖經氧化劑（如高碘酸鈉）氧化反應制得，也可由其他方法制備或直接購買。

本發明中，用以調節大豆分離蛋白水溶液ph值的物質為氫氧化鈉水溶液，其濃度為0.1-1.0mol/l；也可為其他可以調節溶液ph的溶液或物質。

本發明中，所用大豆分離蛋白與氧化葡聚糖質量比為95:5到50:50。

本發明中，步驟（1）中所述的大豆分離蛋白水溶液中還可包含功能性無機納米粒子（如金納米團簇、金納米顆粒等），以及抗癌或抗生藥物分子（如鹽酸阿霉素、鹽酸四環素）等。

本發明所述的制備方法獲得的高強度、高彈性的大豆蛋白基天然高分子水凝膠，最大可承受90%的壓縮形變，其壓縮強度可達400kpa；在壓縮形變到達80%時水凝膠仍可呈現幾乎完全的回彈性。

本發明制備的功能性大豆蛋白基天然高分子水凝膠，具有良好的生物相容性，并具有熒光成像、光熱轉換、藥物緩釋、抗癌、抑菌等性能，可用于食品加工、生物傳感、生物醫藥及納米功能材料等領域。

采用本發明方法制備大豆蛋白基天然高分子水凝膠，具有以下優點：

（1）本發明所述的水凝膠原料為來源廣泛、成本低廉的大豆分離蛋白，制得的水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性。

（2）本發明采用的葡聚糖是一種天然多糖，由葡聚糖改性得到的氧化葡聚糖仍保留了天然葡聚糖良好的生物相容性。

（3）本發明所述的凝膠制備方法，僅通過混合靜置即可形成均一穩定的凝膠，制備方法簡單便捷，重復性好。

（4）本發明所述的凝膠制備方法，可以通過調節氧化葡聚糖的含量和體系ph值來有效調控凝膠的形成時間和力學性能。

（5）相比以往的大豆蛋白基凝膠材料，本發明制備的大豆分離蛋白基水凝膠的力學性能得到了顯著的提升，并表現出超強的彈性。

（6）細胞實驗顯示，本發明制得的大豆蛋白基天然高分子水凝膠具有良好的生物相容性。

（7）本發明所述大豆蛋白基天然高分子水凝膠可以作為載體，制備多功能的高強度、高彈性的水凝膠材料。

附圖說明

圖1為大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠的壓縮測試力學性能曲線。

圖2為大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠的循環壓縮曲線。

圖3為細胞實驗中大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠表面細胞生長情況的熒光顯微鏡圖像。

圖4為365nm紫外光照射下金納米團簇@大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠的熒光圖像。

圖5為鹽酸四環素@大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌圈圖像。

具體實施方式

下面結合具體實施例，以進一步闡述本發明。有必要在此指出的是，實施例只用于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容做出一些非本質的改進和調整。

實施例1

取質量分數為10wt%的大豆分離蛋白水溶液，加入濃度0.5mol/l的氫氧化鈉水溶液，調節大豆分離蛋白水溶液的ph至9.0；然后加入質量分數為10wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質量比為70:30。將上述溶液混合均勻后倒入模具，在室溫（25℃）下靜置1.5min，即可得到大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠。該凝膠在壓縮應變為87%時斷裂，其斷裂強度為401kpa，如圖1所示；循環壓縮測試中，樣品可以在壓縮應變80%后實現完好的回彈，幾乎沒有滯后圈，如圖2所示。用pbs漂洗至中性后進行細胞實驗，3天的培養期內細胞的存活率保持在95%以上，未表現出細胞毒性。

實施例2

取質量分數為9wt%的大豆分離蛋白水溶液，加入濃度1.0mol/l的氫氧化鈉水溶液，調節大豆分離蛋白水溶液的ph至12.0；然后加入質量分數9wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質量比為60:40。混合倒入模具，在室溫（25℃）下靜置0.1min，即可得到大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠。該凝膠在壓縮應變為88%時斷裂，其斷裂強度為376kpa；循環壓縮測試中，樣品可以在壓縮應變80%后實現完好的回彈，幾乎沒有滯后圈。用pbs漂洗至中性后進行細胞實驗，3天的培養期內細胞的存活率保持在95%以上，未表現出細胞毒性，細胞可以在凝膠的表面良好生長，如圖3所示。

實施例3

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的金納米團簇水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質量分數為8wt%。然后加入8wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質量比為95:5。混合后在室溫下（25℃）靜置35min，即可得到負載有金納米團簇的復合水凝膠。該凝膠在365nm的紫外光照射下呈現均勻的粉色熒光，如圖4所示，表明金納米團簇可以在大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠中分散均勻，且大豆分離蛋白和氧化葡聚糖的引入并不會影響其熒光特性。因此，大豆分離蛋白基水凝膠可以作為基質，穩定負載金納米團簇，可將該大豆分離蛋白基水凝膠用于熒光成像領域。

實施例4

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的金納米顆粒水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質量分數為7wt%。然后加入7wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質量比為90:10。混合后在室溫下（25℃）靜置50min，即得到負載有金納米顆粒的復合水凝膠。將該凝膠用808nm的近紅外光照射，在5min內從室溫升高到38.8℃，達到63.8℃，超過了一般癌細胞的耐受溫度（43℃），表明該凝膠具有良好的光熱轉換性能，可用于光熱治療領域。

實施例5

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的鹽酸阿霉素水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質量分數為6wt%。然后加入6wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質量比為80:20。混合后在室溫下（25℃）靜置95min，即可得到負載有抗癌藥物鹽酸阿霉素的復合水凝膠。在37℃下，pbs(ph=7.4)緩沖液中考察凝膠的藥物緩釋行為。第一天，凝膠中鹽酸阿霉素的釋放比例為11%；七天后，鹽酸阿霉素的釋放比例為28%，并呈現持續釋放的趨勢。該結果表明大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠對于鹽酸阿霉素具有良好的緩釋作用，有望作為藥物緩釋載體，用于癌癥治療領域。

實施例6

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的鹽酸四環素水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質量分數為5wt%。然后加入5wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質量比為50:50。混合后在室溫下（25℃）靜置120min，即可得到負載有抗生素鹽酸四環素的復合水凝膠。取100μｌ載藥復合凝膠，置于鋪有金黃色葡萄球菌菌液的培養基上，再放入37℃生物培養箱中培養24小時，可觀察到明顯的抑菌圈（如圖5）。該結果表明凝膠釋放出的鹽酸四環素能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生長，有望用于抗菌材料及傷口敷料領域。