miR?664a?5p的檢測試劑在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應用的制作方法

本發明屬于生物醫藥領域，涉及mir-664a-5p的檢測試劑在制備肝癌診斷試劑/試劑盒的應用，以及一種診斷肝癌的試劑及試劑盒。

背景技術：

我國是肝癌大國，肝癌的發病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的準確診斷具有重要的現實意義。

現時，國際上通常用來篩查肝癌的生物標志物是血清afp(甲胎蛋白)。但其敏感性只有39％至65％，特異性只有76％至94％。由于其檢測肝癌的敏感性跟特異性不甚理想，因此美國的治療指南不推薦血清afp用于肝癌的診斷。中國跟歐洲的治療指南都指出，正常個體的afp水平應小于20ng/ml，大于400ng/ml則可提示肝癌的診斷。而20至400ng/ml則是診斷的“灰色地帶”。因此利用afp篩查肝癌容易導致誤診漏診。

除了血液取樣方式，另一種診斷方式是組織取樣診斷。然而，肝組織取樣對人體破壞性強，因此，亟須一種沒有創傷式而準確的診斷方法。

人體唾液腺中存在許多毛細血管網，因此，唾液是血液循環的末端產物。血液中存在的分子物質，例如dna、rna、蛋白、藥物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被認為是人體健康狀態的一面鏡子，能反映出機體的各種內環境狀態，例如癌癥、感染、系統性疾病等。美國的食品及藥物管理局(fda)已經批準了利用唾液檢測藥物濫用、hiv感染、激素水平、中毒等試劑在市場上應用，現已在全美都已經得到普及。在臨床中，于唾液中尋找分子標記物是最理想的方法，因為收集唾液存在簡單、方便、無創、經濟、不會引起患者不安、操作者易于掌握等優點。研究已經證實了唾液中的轉錄物、蛋白、代謝物和其他分子物質能檢測出口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥綜合征等其他口腔或者系統性疾病。體內的微小rna(microrna，mirna)與包括肝癌在內的多種癌癥的發病與發展密切相關。研究發現多種mirna在肝癌組織中表達失調，組織中表達失調的mirna可作為生物標記物對肝癌有較佳的診斷價值。但mir-664a-5p是否可作為生物標記物協助診斷肝癌，目前尚無報道。唾液中的mir-664a-5p是否可作為生物標記物協助診斷肝癌，更無報道。

技術實現要素：

本發明目的在于提供mir-664a-5p在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應用。

本發明的目的還在于同時提供了一種肝癌診斷的試劑/試劑盒。

本發明的上述目的通過以下技術手段實現：

mir-664a-5p為近2年來新發現的mirna。編碼的基因位于人類第1號染色體上grch38基因組的第220200538至220200619堿基序列上。總長度為24bp。無突變的mir-664a-5p序列如：

seqidno：1

acuggcuagggaaaaugauuggau

一方面，本發明提供了mir-664a-5p的檢測試劑在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應用；優選地，所述的mir-664a-5p的序列如seqidno：1所示。

一方面，本發明提供了mir-664a-5p在篩選抗肝癌藥物中的應用；

一方面，本發明提供了一組mirna引物，所述mirna引物為mir-664a-5p的反轉錄引物，包括seqidno：2和seqidno：3所示的引物對。

一方面，本發明提供了上述的引物在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應用。

另一方面，本發明提供一種肝癌診斷試劑/試劑盒，其特征在于，所述的診斷試劑/試劑盒含有檢測樣本中mir-664a-5p表達量的試劑。

本發明中，所述的試劑/試劑盒檢測的樣本為組織、血液、唾液；優選地，為唾液。因為收集唾液存在簡單、方便、無創、經濟、不會引起患者不安、操作者易于掌握等優點。

所述的檢測樣本中mir-664a-5p表達量為通過qpcr、基因微陣列對mir-664a-5p進行定量分析；作為優選的實施方式，采用qpcr對mir-664a-5p進行定量分析。

所述的試劑/試劑盒的檢測結果為：當樣本中的mir-664a-5p的表達量大于1.46時，肝癌陽性，當樣本中的mir-664a-5p的表達量小于1.46時，肝癌陰性；更優選地，當唾液中的mir-664a-5p的表達量大于1.46時，肝癌陽性；當唾液中的mir-664a-5p的表達量小于1.46時，肝癌陰性。所述的mir-664a-5p的表達量是通過qpcr相對表達量法測定的，其中內參snu6。

所述的試劑/試劑盒含有mir-664a-5p的逆轉錄擴增引物，用于檢測mir-664a-5p的表達量。作為一種實施方式，所述的擴增引物如seqidno：2和seqidno：3所示，通過qpcr檢測mir-664a-5p的表達量。

進一步地，所述的試劑/試劑盒還含有蛋白酶；優選地，所述的蛋白酶為蛋白酶k；

進一步地，所述的試劑/試劑盒還含有酸酚氯仿混合物；優選地，所述的酸酚氯仿混合物為鹽酸-苯酚-氯仿混合物；更優選地；苯酚與氯仿的體積比為4.5-5.5:1；更優選地，所述的酸酚氯仿混合物ph值為4.3-4.7；

進一步地，所述的試劑/試劑盒還含有rna酶抑制劑；優選地，所述的rna酶抑制劑為焦碳酸二乙酯(depc)。

作為一種試劑/試劑盒的使用方法：其包括提取唾液中總rna后，進行mir-664a-5p的逆轉錄，再通過qpcr反應檢測mir-664a-5p水平。

提取唾液mir-664a-5p的方法可采用以下步驟：

s1.取唾液樣本，加入蛋白酶，60-65℃孵育以去除唾液蛋白；

s2.加入酸酚氯仿混合物后，10000-12000g離心4-6分鐘，收集上清；

s3.加入1.2-1.4倍體積的乙醇，再經5000-6000g離心20-60秒過濾離心，

棄濾液；

s4.加入預熱的rna抑制酶水，10000-12000g離心20-60秒，收集rna。

另一方面，本發明還提供了一種檢測肝癌的芯片，特征在于，所述的芯片包括固相載體以及固定于固相載體上的生物標志物mir-664a-5p的探針。

所述的mir-664a-5p的序列如seqidno：1所示。

另一方面，本發明還提供了一種肝癌診斷系統：其特征在于，所述的檢測系統含有：

a)檢測構件：所述的檢測構件用以檢測待測樣本中mir-664a-5p的表達量；

b)結果判斷構件：所述的結果判斷構件用于根據檢測構件所檢測的mir-664a-5p的表達量得出肝癌的患病風險高低或是患病風險值；

所述的樣本為組織、血液、唾液；更優選地，為唾液；

所述的檢測構件為qpcr構件、基因微陣列構件；更優選地，為qpcr構件；

所述的結果判斷構件為軟件，其含有輸入模塊、分析模塊和輸出模塊；輸入模塊用于輸入mir-664a-5p的表達量；分析模塊用于根據mir-664a-5p的表達量，分析出肝癌的患病風險高低或是患病風險值；輸出模塊用于輸出分析模塊的分析結果；

所述的診斷系統中，當樣本中的mir-664a-5p的表達量大于1.46時，診斷結果為肝癌陽性，當樣本中的mir-664a-5p的表達量小于1.46時，診斷結果為肝癌陰性；更優選地，當唾液中的mir-664a-5p的表達量大于1.46時，診斷結果肝癌陽性；當唾液中的mir-664a-5p的表達量小于1.46時，診斷結果肝癌陰性；所述的mir-664a-5p的表達量是通過qpcr相對表達量法測定的，其中內參為snu6。

本發明的一大突破在于，發現在肝癌患者的血液、組織樣本，尤其是唾液樣本中，均存在大量的mir-664a-5p(圖3)。mir-664a-5p其穩定而大量地存在，能被高重現性地檢出。而健康人群的樣本中，該標記物表達水平非常低。這使得mir-664a-5p成為一種良好的樣本尤其是唾液標記物，對于肝癌的檢測或診斷具有突破性的意義。

本發明的一個優選的方案是以唾液作為樣本來進行肝癌標記物的檢測，該方法取樣簡單、無創。然而，以唾液作為檢測樣本的要求較高，需要尋找到能分泌到唾液中的，且在唾液中能穩定存在的標記物。盡管目前已有大批的肝癌標記物被發現，這些標記物存在于組織樣品或血液樣品中，然而，同樣的標記物采用唾液樣本取樣，往往是另一個結果，不能用作肝癌診斷。這很可能是因為能被分泌到唾液中的標記物本身就很少，并且唾液中存在大量的酶，標記物容易降解。而本發明所發現的這個標記物不僅存在于組織中，并且存在于唾液中并且可以穩定地被檢測，這使得本發明具有非常突出的取樣優勢。

本發明首先通過美國agilent基因芯片(圖1a)和qpcr精確定量技術(圖1b)，發現mir-664a-5p在肝癌組織中表達顯著升高。同時，通過生物分析學發現mir-664a-5p在肝癌等多種癌基因中起著關鍵的調控作用(圖2)。接著利用定量聚合酶鏈反應技術(qpcr)更精確地檢測mir-664a-5p，利用生物統計學分析，發現相對于健康對照者，mir-664a-5p在肝癌患者的血漿及唾液中的顯著表達升高。同時，它在組織、血漿及唾液中的表達水平互為顯著正相關(圖3)，提示唾液中的mir-664a-5p來源于肝癌組織的分泌。接著發現相對與健康對照者、乙肝攜帶者、慢性活動性乙肝患者、肝硬化患者及在我國及全球致死率排前10位的癌癥患者(除去肝癌，男女分開統計)，mir-664a-5p在肝癌患者的唾液中顯著高表達(圖4、圖5)。提示mir-664a-5p對肝癌的診斷具有良好的特異性。

最后建立預測診斷肝癌的roc(receiveroperatingcharacteristic)曲線推斷，健康個體的值應小于1.4626265。若受檢個體的唾液mir-664a-5p的表達水平大于此值，則受檢個體判定為肝癌的敏感性為88％，特異性為80％。唾液mir-664a-5p在成為協助篩查乙肝相關性肝癌的標志物方面具有良好的前景，收集唾液的取樣方式簡單、方便、無創、價廉、不會引起患者不安、操作者易于掌握、受檢者易于接受，且準確率高，對肝癌的早診早治，降低死亡率，減輕我國的醫療負擔具有重大的意義。

附圖說明

圖1為基因芯片(a)和qpcr(b)技術發現mir-664a-5p在肝癌組織中顯著高表達，其中圓為正常組織mir-664a-5p表達量，方框為肝癌組織mir-664a-5p表達量。

圖2為生物信息學發現mir-664a-5p對肝癌的發生發展起著重要的調控作用。

圖3為組織、血漿、唾液mir-664a-5p表達量的相關性分析。

圖4為不同人群唾液樣本中的mir-664a-5p表達水平。

圖5為唾液mir-664a-5p在致死率排全球前10位癌癥患者間的表達差異性。

圖6為唾液mir-664a-5p的qpcr擴增曲線(圖6a)和溶解曲線(圖6b)和測序結果(圖6c)。

圖7為唾液mir-664a-5p對肝癌診斷價值推斷的roc曲線。

圖8為不同血清afp組別在肝癌患者中的比例。

圖9為不同afp表達水平肝癌患者的唾液mir-664a-5p檢出水平。

具體實施方式

以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案，具體實施例不代表對本發明保護范圍的限制。其他人根據本發明理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬于本發明的保護范圍。

本發明中，“表達量”用2^-δδct法算出并表示。ct值為qpcr對每個標本檢測到的數值。每個樣本的δct＝mirna–snu6；δδct＝每個樣本的δct-健康對照組δct的平均值。

實施例1唾液采集

在唾液采集前，研究個體需禁食、禁飲、禁煙和禁止口腔清潔2h以上。

為增加唾液收集量，采用2％檸檬酸溶液濕潤無菌棉簽棉花頭，然后將棉花頭放于研究個體舌頭一側的后側壁約5s，吐出唾液后，再將棉簽放到另一側的舌頭后側壁。如此反復收集。唾液收集量需達5ml以上，收集管使用50ml無菌無酶離心管。4℃、3000g離心15min取上層上清至1.5mleppendoff管，再以4℃、12000g離心10min后再棄沉淀取上清。標本處理后均置-80℃保存。

實施例2唾液總rna的提取

1.將1ml唾液平均分裝在兩支1.5ml的無酶ep管上，即每支ep管都盛有500μl的唾液，然后向每只ep管加入蛋白酶k(20mg/ml)15μl，混勻，放于65℃水浴鍋孵育過夜。因為唾液中含有較多的消化酶類等蛋白，影響后續提取唾液rna的效果，因此此法可去除唾液蛋白對實驗的影響。

2.兩支ep管各加0.5ml的酸酚氯仿混合物(主要成分為鹽酸、苯酚與氯仿)到上述唾液混合液中。

酸酚氯仿的配置

2.1苯酚與氯仿的體積比為5:1

2.2用濃鹽酸調ph值，ph值定在4.5左右，此ph值最利于提取rna。混勻。

3.加入后手動搖勻30到60秒

4.室溫下10000g離心5分鐘。離心后中層液體需緊致，否則重新離心。

5.收集上清，需謹慎，不能攪動下層液相。

6.將1.2-1.4倍體積的100％乙醇加到上清液中。例如收集到500μl上清，則加625μl無水乙醇。

7.將過濾管放入收集管內，將上述混合物加到過濾管中(過濾管和收集管市場上有銷售)。

8.6000g離心30秒。

9.丟棄過濾液。重復空甩離心1次。保留收集管。

10.將700μl的75％乙醇加到過濾管中，離心15秒。丟棄過濾液。將過濾管重新放入原來的收集管中。

11.重復第10步，再洗滌一次。

12.丟棄過濾液，將過濾管放入同樣的收集管中。空甩離心1分鐘。

13.將過濾管放入新的收集管中。加入95℃預熱depc水。蓋好蓋子。離心30秒。收集rna。

14.收集洗脫液。洗脫液即溶解有從唾液中提取的總rna。提取后的總rna在-80℃以下保存。

實施例3唾液mir-664a-5p逆轉錄及表達量檢測

1.唾液mir-664a-5p的逆轉錄反應

取2μlrna進行反轉錄。每2μl的rna中加入2μl的rtprimer和7μl的無核酸酶水。70℃反應10min后立即冰浴2min。在上述11μl混合物中分別加入5μlrtbuffer(takara公司，貨號2641a)、2μldntp(takara公司2.5mm,規格，貨號dr001b)、0.5μlrnaseinhibitor(takara公司，40u/μl規格，貨號2313a)、0.5μlrt酶(takara公司，200u/μl規格，貨號2641a)、6μlddh2o，然后繼續進行反轉錄，反應條件為42℃60min,70℃10min,4℃∞。

2.唾液mir-664a-5p的表達量檢測(qpcr反應)

采用qpcr儀，相對定量法表示，其中，內參基因采用snu6。

取逆轉錄產物3μl作為模板，用sybrpremixextaqⅱ試劑盒(takara公司，貨號rb820a)進行rt-qpcr檢測，20μl反應體系中加入9μl的5×sybrpremixbuffer，0.8μl的上游引物，0.8μl的下游引物,和6.4μl經depc處理的無酶水。

上游引物序列seqidno:2

5’-gtgttaagttcagttcagggtag-3’

下游引物序列seqidno:3

5’-cattttgtaggctggggataaatg-3’

所有反應采用3復孔,反應條件為95℃2min,然后95℃5s,60℃10s,50個循環。溶解曲線設置：meltcurve:65.0to95.0℃,increment0.5℃for0.05min+plateread。采用bio-radcfx實時定量pcr儀進行檢測。

實施例4擴增曲線、溶解曲線和測序分析

在以唾液為實驗樣本，經過上述總rna提取、反轉錄、qpcr反應后，進行擴增、溶解曲線及產物測序分析。

得出mir-664a-5p的qpcr擴增曲線、溶解曲線及測序結果如圖6所示。qpcr擴增曲線、溶解曲線及測序結果如圖6可得出：結果表明經上述方法檢測唾液mir-664a-5p，能成功特異地檢測出唾液mir-664a-5p的表達水平。

實施例5唾液樣本中的mir-664a-5p表達水平檢測

收集健康對照個體(50例)、乙肝攜帶者(50例)、慢性活動性乙肝患者(50例)、肝硬化患者(50例)、肝癌患者(包括早期肝癌患者的術前(50例)和術后(50例)、及晚期肝癌(50例)共350例唾液樣本。男女比例1:1。

檢測唾液mir-664a-5p在各組中的表達水平與差異性。唾液處理及檢測方法如實施例3所示。

結果如圖4所示。唾液mir-664a-5p在肝癌患者中的表達水平都顯著高于其它對照組。

通過統計學分析，構建roc曲線，可得出唾液mir-664a-5p對肝癌診斷的敏感性88％，特異性可達80％。結果如圖7所示。

作為對比實驗，發明人還檢測了所收集的肝癌患者的血清afp水平。在我們收集的肝癌患者中，只有20％的個體的血清afp水平達到肝癌的診斷水平，約50％的個體處于正常水平。結果如圖8所示。

實施例6致死率排名前10的癌癥中mir-664a-5p的表達量檢測

收集我國和全球致死率排名前十的癌癥患者(具體見圖5)，以及健康對照組，男女檢測個體分開統計。肝癌患者共100例，男女各50例。健康對照者共50例，男女各25例。其它癌癥患者男女各6例。

檢測唾液mir-664a-5p在各組中的表達水平與差異性。唾液處理及檢測方法如實施例3所示。

實驗結果如圖5所示，在我國及全球致死率排前10位的癌癥患者(男女分開統計)，mir-664a-5p在肝癌患者的唾液中顯著高表達提示mir-664a-5p對肝癌的診斷具有良好的特異性。

對比例其他現有肝癌標記物的唾液樣本檢測結果

血清afp為當今世界上現有可協助肝癌診斷的生物標志物。但其敏感性和特異性非常低。發明人進一步分析了不同afp表達水平患者的唾液mir-664a-5p檢出水平，結果如圖9所示.無論肝癌患者血清的afp表達水平如何，唾液mir-664a-5p均能檢測出肝癌。它在不同afp分組肝癌患者的唾液中都出現顯著性高表達。唾液mir-664a-5p比血清afp對肝癌更具有診斷價值。

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<110>中山大學附屬第三醫院

<120>mir-664a-5p的檢測試劑在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應用

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