本發明屬于動物繁殖技術領域，涉及一種用于農業-畜牧獸醫繁殖的技術，具體涉及一種提高牛體外受精胚胎培養效率的方法，更具體的說，本發明涉及牛體外受精胚胎培養液在牛體外受精胚胎培養中的應用。進一步的，本發明還涉及使用該牛體外受精胚胎培養液進行牛體外受精胚胎培養的方法。特別是，本發明牛體外受精胚胎培養的方法具有優異的成本優勢。
背景技術：
體外受精(invitrofertilization)或(externalfertilization)是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環境中完成受精過程的技術，英文簡稱為ivf。由于它與胚胎移植技術(et)密不可分，又簡稱為ivf-et。在生物學中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物(test-tubeanimal)。這項技術成功于20世紀50年代，在最近20年發展迅速，現已日趨成熟而成為一項重要而常規的動物繁殖生物技術。
體外受精技術對動物生殖機理研究、畜牧生產、醫學和瀕危動物保護等具有重要意義。如用小鼠、大鼠或家兔等作實驗材料，體外受精技術可用于研究哺乳動物配子發生、受精和胚胎早期發育機理。在家畜品種改良中，體外受精技術為胚胎生產提供了廉價而高效的手段，對充分利用優良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價值。在人類，ivf-et技術是治療某些不孕癥和克服性連鎖病的重要措施之一。體外受精技術還是哺乳動物胚胎移植、克隆、轉基因和性別控制等現代生物技術不可缺少的組成部分。
隨著現代農業科技的發展，為了更充分利用良種母牛的繁殖潛力，加速遺傳育種進程，在生產實踐中應用高效的繁殖新技術成為必然。活體采卵(ovumpickup，opu)和體外受精技術(invitrofertilization，ivf)是二十世紀八十年代快速發展起來的胚胎工程新技術，二者相結合可獲得大量遺傳系譜明確的胚胎，從而縮短世代間隔。目前，這兩種技術已經成為歐美和大洋洲等畜牧業發達國家的農場主為擴大良種母牛群而采用的重要繁殖技術。然而，采用常規的牛胚胎培養體系(cr1aa和sof液)，牛體外受精的囊胚發育率較低，而且胚胎質量也遠不及體內胚胎，導致胚胎移植受體后的妊娠率低，因此如何提高囊胚發育率及胚胎質量成為體外受精胚胎生產的重點和研究的焦點。
早在1878年，德國人scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動物的體外受精技術。但直到1951年，美籍華人張民覺和austin分別發現精子體外獲能現象后，體外受精技術才獲得了突破性進展。牛體外受精技術受到卵母細胞的體外成熟、精子的體外獲能、受精卵的體外培養環境等多個方面的影響。
胚胎的體外培養是ivf技術的一個關鍵環節，亦是卵母細胞體外成熟和體外受精技術最終效果的體現和檢驗。在體外受精后，受精卵在向囊胚發育過程中將需經歷一系列重要的變化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因組的激活、致密化以及形成囊胚。這一過程中，外界環境的變化會導致基因表達發生改變，從而影響胚胎的正常發育及質量。目前，哺乳動物早期胚胎的體外培養研究主要集中在改善培養液成分以滿足不同發育階段的胚胎營養需求。基于rosenkrans等(rosenkrans，c.f.，jr.andn.l.first，effectoffreeaminoacidsandvitaminsoncleavageanddevelopmentalrateofbovinezygotesinvitro.janimsci，1994.72(2):p.434-7)開發的charlesrosenkrans1(cr1)培養液和tervit等(tervit，h.r.，d.g.whittingham，andl.e.rowson,successfulcultureinvitroofsheepandcattleova.jreprodfertil,1972.30(3):p.493-7)開發的合成輸卵管液(syntheticoviductalfluid，sof)，經多年不斷改進逐步形成了兩種培養體系。據hakansagirkaya等(sagirkaya,h.,etal.,developmentalpotentialofbovineoocytesculturedindifferentmaturationandcultureconditions.animreprodsci,2007.101(3-4):p.225-40)和somfai等(somfai,t.,etal.,developmentofbovineembryosculturedincr1aaandivd101mediausingdifferentoxygentensionsandculturesystems.actavethung,2010.58(4):p.465-74)研究成果表明，cr1aa培養液用于牛胚胎培養有較好的效果，可以廣泛應用于牛的胚胎培養；thompson,j.g.等(thompson,j.g.,etal.,effectofinhibitorsanduncouplersofoxidativephosphorylationduringcompactionandblastulationofbovineembryosculturedinvitro.jreprodfertil,2000.118(1):p.47-55)和jeanm.feugang等(feugang,j.m.,o.camargo-rodriguez,ande.memili,culturesystemsforbovineembryos.livestockscience,2009.121(2-3):p.141-149)的研究結果顯示，sof培養液也是一種適合于牛胚胎培養的培養體系。張志平等(張志平,安志興,張銹,張涌,牛胚胎培養體系的優化.西北農林科技大學學報,2006.34)和桑國俊等(桑國俊,牛卵母細胞及體外胚培養技術研究.2008)研究結果也顯示，經過優化的cr1aa和sof培養液均適合于牛的體外胚胎培養，均取得良好的培養效果。哺乳動物早期胚胎發育是一個高度協調且精確調節的過程。在進化過程中，配子細胞逐步形成了一系列的分子級聯網絡，以保證胚胎發育周期系統地進行。在發育過程中，胚胎的內外活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ros)與抗氧化劑的平衡對早期胚胎發育起著決定性作用。
大多生化反應均產生ros，其在細胞內、外均有著重要的作用，一部分ros起著信號分子的作用，但是大多數ros對機體是有害的。brooker,r.j.等(brooker,r.j.,genetics:analysisandprinciples(4thed.).mcgraw-hillscience,2011)報道，ros可以引起細胞dna損傷、不飽和脂肪酸的氧化、蛋白質中氨基酸的氧化甚至可以導致某些酶的失活。一般來說，ros以四種形式存在，其中h2o2氧化作用較強，是引起氧化傷害的最主要因素。
大量研究表明，谷胱甘肽(gsh)是以非蛋白質形式存在的一種抗氧化劑，能夠清除多種自由基：超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、次氯酸和脂氧自由基，并且能夠維持細胞內外氧化還原平衡。細胞內外環境gsh和ros水平是影響受精卵發育過程中的兩個重要因素。早在2000年，dematos等(dematos,d.g.andc.c.furnus,theimportanceofhavinghighglutathione(gsh)levelafterbovineinvitromaturationonembryodevelopmenteffectofbeta-mercaptoethanol,cysteineandcystine.theriogenology,2000.53(3):p.761-71)曾通過在體外胚胎培養過程中添加β-巰基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸來提高囊胚率。
盡管體外受精技術能成功應用于許多哺乳動物，但由于體外受精的囊胚率低而導致體外受精胚胎的生產成本高、效率低，限制了該技術在牛快速擴繁實踐中的廣泛應用。因此，如何能夠降低成本并提高牛ivf胚胎生產效率和胚胎質量成為亟待解決的問題。
目前，牛體外受精的技術體系中主要以cr1aa和sof液為胚胎體外培養液，并在此基礎上進行改進，囊胚發育率均有不同程度的提高，囊胚發育率平均為30％-40％。對于囊胚質量，可以通過囊胚細胞總數、icm細胞數/總細胞數比例、細胞凋亡率來評估。囊胚細胞總數根據囊胚所處階段的不同而不同，s.iwasaki等(iwasaki,s.andt.nakahara,cellnumberandincidenceofchromosomalanomaliesinbovineblastocystsfertilizedinvitrofollowedbycultureinvitroorinvivoinrabbitoviducts.theriogenology,1990.33(3):p.669-75)獲得的牛早期囊胚總細胞數平均為44，icm細胞數/囊胚總細胞數比例為15.8％左右；andrewj.watson等(watson,a.j.,etal.,impactofbovineoocytematurationmediaonoocytetranscriptlevels,blastocystdevelopment,cellnumber,andapoptosis.biolreprod,2000.62(2):p.355-64)統計牛囊胚細胞凋亡率約為7.7％-13％。
cn103898046b(中國專利申請號201410073635.4)公開了一種專用于牛體外受精胚胎的培養液，所述培養液配方為：nacl109.5mm、kcl3.1mm、nahco326.2mm、mgcl2·6h2o0.8mm、kh2po31.19mm、丙酮酸鈉0.4mm、葡萄糖1.5mm、半乳糖酸鈣5mm、10v/v％胎牛血清、l-谷氨酰胺1mm、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸和谷胱甘肽3mm，以水配制；所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-鹽酸精氨酸6.32g/l、l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、l-異亮氨酸2.625g/l、l-亮氨酸2.62g/l、l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、l-蛋氨酸0.755g/l、l-苯丙氨酸1.65g/l、l-蘇氨酸2.38g/l、l-色氨酸0.51g/l、l-酪氨酸1.8g/l和l-纈氨酸2.34g/l；所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-丙氨酸0.89g/l、l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、l-天冬氨酸1.33g/l、l-谷氨酸1.47g/l、甘氨酸0.75g/l、l-脯氨酸1.15g/l和l-絲氨酸1.05g/l。將牛體外受精胚胎置于上述培養液中進行體外培養，據信結果顯示明顯優于未添加gsh的對照組，提高了囊胚發育率及胚胎質量，降低體外生產胚胎的成本，為牛ivf技術應用于實踐提供實驗基礎，可大大加速遺傳育種進程。
其他參考文獻：
陳大元.受精生物學.2003,北京:科學出版社；
方俊順.牛胚胎體外生產技術研究.《中國優秀碩士學位論文全文數據庫.農業科技輯》.2007,(第4期)；
曹海清.卵丘細胞和培養條件對牛體外胚胎生產效率的影響.《中國優秀碩士學位論文全文數據庫.農業科技輯》.2008,(第9期)；
i.h.kimetal.effectofexogenousglutathioneontheinvitrofertilizationofbovineoocytes.theriogenology.1999,vol.52(3)。
然而，本領域仍然期待有性能改進的牛體外受精胚胎的培養的方法，例如仍然期待有提高牛體外受精胚胎培養效率的方法，例如有具有優異的成本優勢的牛體外受精胚胎培養的方法。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種性能改進的牛體外受精胚胎的培養的方法，特別是期待提高牛ivf胚胎生產效率和胚胎質量。更具體的，本發明為達成上述目的而需要提供一種專用于牛體外受精胚胎的培養液和以及使用該培養進行牛體外受精胚胎培養的方法。本發明人已經出人意料的發現，使用本發明方法呈現優異的技術效果，本發明因此發現而得以完成。
為此，本發明第一方面提供了一種牛體外受精胚胎培養液，該培養液包含：
109-110mm的nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
2-3v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，該培養液包含：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中所述必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-鹽酸精氨酸6.32g/l、
l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、
l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、
l-異亮氨酸2.625g/l、
l-亮氨酸2.62g/l、
l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、
l-蛋氨酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸1.65g/l、
l-蘇氨酸2.38g/l、
l-色氨酸0.51g/l、
l-酪氨酸1.8g/l、和
l-纈氨酸2.34g/l。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-丙氨酸0.89g/l、
l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、
l-天冬氨酸1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘氨酸0.75g/l、
l-脯氨酸1.15g/l、和
l-絲氨酸1.05g/l。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為1～7mm。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為3～5mm。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為1mm、3mm、5mm或7mm。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為3mm或5mm。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為3mm。
根據本發明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎培養液，其中還包含枸櫞酸鈉和麥芽糖。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.03～0.05w/v％和0.01～0.03w/v％。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.04w/v％和0.02w/v％。已經出人意料的發現，在牛體外受精胚胎培養液中同時添加微量的枸櫞酸鈉和麥芽糖時，有助于提高囊胚孵化率，并且其它指標不受影響。囊胚孵化率是囊胚質量的重要評價指標，在其它指標不受影響的前提下提高囊胚孵化率，對于牛體外受精胚胎培養工作具有重要意義。另外，還發現，在添加此枸櫞酸鈉和麥芽糖的情況下，可以大大減小牛體外受精胚胎培養液中胎牛血清的濃度，并且獲得基本相同的培養效果；由于牛體外受精胚胎培養液中胎牛血清相對于其中的其它組分(包括枸櫞酸鈉和麥芽糖)是極為昂貴的，牛體外受精胚胎培養液的主要成本在于胎牛血清，胎牛血清的用量減小對于提高牛體外受精胚胎培養效率、降低生產成本是極為有利的。
進一步的，本發明第二方面提供了一種以提高的效率培養牛體外受精胚胎的方法，該方法包括如下步驟：
將牛體外受精胚胎置于牛體外受精胚胎培養液中，在38.5℃、0.5％co2、100％濕度條件下進行胚胎體外培養。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，其中胚胎體外培養包括如下步驟：
(1)精卵共孵育8h后，取出卵母細胞，使用1mg/ml的透明質酸酶消化處理3min，然后使用移液槍反復吹打，直至卵丘細胞基本脫落；
(2)使用含10％fbs的tcm199終止透明質酸酶的消化，用口吸管將疑似受精卵在添加有牛血清白蛋白(通常亦縮寫為bsa)的胚胎前期培養液中洗3次后，放入胚胎前期培養液滴中進行培養，培養條件為38.5℃、0.5％co2、100％濕度；
(3)48h后，將卵裂至4-8細胞的胚胎移至胚胎后期培養液(其即為本發明的牛體外受精胚胎培養液)滴中進行培養(培養條件為38.5℃、0.5％co2、100％濕度)，48h后半量更換胚胎后期培養液并繼續培養(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)；
(4)以受精當天為0天開始計時，至第7天時統計囊胚率，至第9天時統計囊胚孵化率(其為孵化囊胚數除以囊胚數所得百分數)。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養液中包含：
109-110mm的nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
2-3v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養液中包含：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養液中的所述必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-鹽酸精氨酸6.32g/l、
l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、
l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、
l-異亮氨酸2.625g/l、
l-亮氨酸2.62g/l、
l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、
l-蛋氨酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸1.65g/l、
l-蘇氨酸2.38g/l、
l-色氨酸0.51g/l、
l-酪氨酸1.8g/l、和
l-纈氨酸2.34g/l。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養液中的所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按比例和濃度配制所得的水溶液：
l-丙氨酸0.89g/l、
l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、
l-天冬氨酸1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘氨酸0.75g/l、
l-脯氨酸1.15g/l、和
l-絲氨酸1.05g/l。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為1～7mm。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為3～5mm。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為1mm、3mm、5mm或7mm。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為3mm或5mm。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，其中所述培養液中谷胱甘肽的濃度為3mm。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，所述牛體外受精胚胎培養液中還包含枸櫞酸鈉和麥芽糖。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.03～0.05w/v％和0.01～0.03w/v％。在一個實施方案中，所述牛體外受精胚胎培養液中枸櫞酸鈉和麥芽糖的濃度分別為0.04w/v％和0.02w/v％。
本發明任一方面或該任一方面的任一實施方案所具有的任一技術特征同樣適用其它任一實施方案或其它任一方面的任一實施方案，只要它們不會相互矛盾，當然在相互之間適用時，必要的話可對相應特征作適當修飾。下面對本發明的各個方面和特點作進一步的描述。
本發明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發明不一致時，以本發明的表述為準。此外，本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發明所表述的含義為準。
本發明使用的胎牛血清可以容易的從市場購得其標準化商品形式，例如可以從各種代理商處購得gibco公司的澳洲胎牛血清(貨號：10099141)、新西蘭胎牛血清(貨號：10091148)、北美胎牛血清(貨號：16000044)、墨西哥胎牛血清(貨號：10437028)等，這些商品化胎牛血清的價格500ml大多在8000元以上，用于本發明牛體外受精胚胎培養液中時胎牛血清是成本主要貢獻者。在本發明上下文的試驗中，如未特別說明，所用的胎牛血清是gibco公司的澳洲胎牛血清(貨號：10099141)。
本發明具有以下優點：本發明通過在培養液中添加一定濃度的谷胱甘肽(glutathione，gsh)，能顯著提高體外胚胎的發育能力。同時對囊胚進行差異染色，區分內細胞團(innercellmass，icm)、滋養層細胞和凋亡細胞，比較總細胞數，并計算icm細胞數/總細胞數比例和凋亡率，結果顯示添加gsh的試驗組優于對照組，提高了囊胚發育率及胚胎質量，降低體外生產胚胎的成本，為牛ivf技術應用于實踐提供實驗基礎，可大大加速遺傳育種進程。另外，已經出人意料的發現，使用具有本發明配方的牛體外受精胚胎培養液能夠顯著提高提高囊胚孵化率，并且其它指標不受影響，囊胚孵化率是囊胚質量的重要評價指標，在其它指標不受影響的前提下提高囊胚孵化率，對于牛體外受精胚胎培養工作具有重要意義。另外，本發明還發現，在添加此枸櫞酸鈉和麥芽糖的情況下，可以大大減小牛體外受精胚胎培養液中胎牛血清的濃度，并且獲得基本相同的培養效果；由于牛體外受精胚胎培養液中胎牛血清相對于其中的其它組分(包括枸櫞酸鈉和麥芽糖)是極為昂貴的，牛體外受精胚胎培養液的主要成本在于胎牛血清，胎牛血清的用量減小對于提高牛體外受精胚胎培養效率、降低生產成本是極為有利的。
具體實施方式
通過下面的實施例可以對本發明進行進一步的描述，然而，本發明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業人員能夠理解，在不背離本發明的精神和范圍的前提下，可以對本發明進行各種變化和修飾。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細描述。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
實施例1：牛體外受精胚胎的培養方法
一、試劑
成熟培養液：含0.01iu/ml的fsh、10iu/ml的lh、1μg/ml雌二醇、100ng/ml的igf、50ng/ml的egf、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10％胎牛血清的tcm-199培養液。
洗精液：含112.0mm的nacl、4.02mm的kcl、2.25mm的cacl2·2h2o、0.52mm的mgcl2·6h2o、0.83mm的kh2po3、37.0mm的nahco3、1.25mm的丙酮酸鈉、10μg/ml的肝素、4mg/ml的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)、10mm的咖啡因、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的水溶液。
受精液：含112.0mm的nacl、4.02mm的kcl、2.25mm的cacl2·2h2o、0.52mm的mgcl2·6h2o、0.83mm的kh2po3、37.0mm的nahco3、1.25mm的丙酮酸鈉、10μg/ml的肝素、4mg/ml的bsa、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的水溶液。
胚胎前期培養液：含109.5mm的nacl、3.1mm的kcl、26.2mm的nahco3、0.8mm的mgcl2·6h2o、1.19mm的kh2po3、0.4mm的丙酮酸鈉、1.5mm的葡萄糖、5mm的半乳糖酸鈣、6mg/ml的bsa、1mm的l-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸的水溶液。
胚胎后期培養液：含109.5mm的nacl、3.1mm的kcl、26.2mm的nahco3、0.8mm的mgcl2·6h2o、1.19mm的kh2po3、0.4mm的丙酮酸鈉、1.5mm的葡萄糖、5mm的半乳糖酸鈣、10v/v％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、1mm的l-谷氨酰胺、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必須氨基酸的水溶液。
所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例/濃度配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-鹽酸精氨酸6.32g/l、l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、l-鹽酸組氨酸一水物2.1g/l、l-異亮氨酸2.625g/l、l-亮氨酸2.62g/l、l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、l-蛋氨酸0.755g/l、l-苯丙氨酸1.65g/l、l-蘇氨酸2.38g/l、l-色氨酸0.51g/l、l-酪氨酸1.8g/l和l-纈氨酸2.34g/l。
所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例/濃度配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為：l-丙氨酸0.89g/l、l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、l-天冬氨酸1.33g/l、l-谷氨酸1.47g/l、甘氨酸0.75g/l、l-脯氨酸1.15g/l和l-絲氨酸1.05g/l。
二、卵母細胞的采集和體外成熟
1.從屠宰場采集牛卵巢，置于37℃生理鹽水中，3h內送至實驗室。
2.使用含有青霉素和鏈霉素的溫熱的生理鹽水將卵巢清洗3-5次。
3.使用真空蠕動泵，用18號針頭抽取5-8毫米卵泡中的卵泡液。
4.體視顯微鏡下挑選卵母細胞-卵丘細胞復合體(cocs)，在洗卵液中將cocs洗滌兩次，在成熟培養液中洗滌一次。
5.將洗干凈的cocs放入含有成熟培養液并覆蓋礦物油的四孔板中，每孔培養50枚cocs，培養22-24h。
三、體外受精
1.將cocs從成熟培養液中移入50μl受精滴中，每滴放15枚cocs。
2.38℃水浴解凍精液，使用5ml洗精液在500g條件下離心5min；棄上清，再加入5ml洗精液離心5min，棄上清，使用洗精液調整精子濃度，使精子濃度約為2×107個/ml。
3.取50μl精液，與含有cocs的受精滴混合成為100μl的液滴。
4.38.5℃，5％co2氣體，95％濕度條件下精卵共孵育8h。
四、胚胎體外培養
1.精卵共孵育8h后，取出卵母細胞，使用1mg/ml的透明質酸酶消化處理3min，然后使用移液槍反復吹打，直至卵丘細胞基本脫落。
2.使用含10％fbs的tcm199終止透明質酸酶的消化，用口吸管將疑似受精卵在添加有牛血清白蛋白的胚胎前期培養液中洗3次后，放入胚胎前期培養液滴中進行培養(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)。
3.48h后，將卵裂至4-8細胞的胚胎移至胚胎后期培養液滴中進行培養(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)，48h后半量更換胚胎后期培養液并繼續培養(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)。
4.以受精當天為0天開始計時，至第7天時統計囊胚率，至第9天時統計囊胚孵化率(其為孵化囊胚數除以囊胚數所得百分數)。
五、胚胎后期培養液中gsh(谷胱甘肽)最適添加濃度篩選
1.配制0.5m的gsh作為儲液。
2.使用gsh儲液，按照終濃度為1mm、3mm、5mm、7mm梯度向胚胎后期培養液中添加配制為胚胎后期培養液的試驗組，以非添加組為對照。
3.分別于培養的第48h、第5天、第7天，統計各個組的卵裂卵與8細胞率、桑椹胚率和囊胚率。
六、胚胎差異染色
1.選取體外培養第7天的囊胚，使用2％多聚甲醛固定20min。
2.使用含0.5％bsa的磷酸鹽緩沖液(pbs-bsa)洗兩次，放入透化液(50μltriton、5μl吐溫80和9.945mlpbs)中，室溫放置30min。
3.使用2m鹽酸室溫處理20min，然后使用100mm的tris-hcl室溫處理10min，使cdx2蛋白能夠與一抗結合。
4.使用pbs-bsa清洗三次，將囊胚放入封閉液(1ml山羊血清、5μl吐溫80和8.995mlpbs)中，室溫封閉1h，然后轉入4℃冰箱封閉過夜。
5.棄去封閉液，cdx2一抗用封閉液按1:200稀釋，室溫孵育2h，棄去一抗稀釋液，用pbs-bsa清洗3次，每次5min。
6.caspase-3一抗(購自cellsignalingtechnology公司)用封閉液按1:200稀釋，室溫孵育2h，棄去一抗稀釋液，用pbs-bsa清洗3次，每次5min。
7.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋cdx2特異性二抗(購自sigma公司)，室溫下避光放置1h。避光條件下棄去二抗稀釋液，用pbs清洗3次，每次5min。
8.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋caspase-3特異性二抗(購自lifetechnologies公司)，室溫下避光放置1h。避光條件下棄去二抗稀釋液，用pbs清洗3次，每次5min。
9.加入10μg/ml的hochest33342染液染細胞核，室溫作用5min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
10.實驗重復三次，每次隨機選取10個囊胚，計算凋亡率、icm細胞數/總細胞數來評估囊胚質量。
七、數據統計
實驗數據采用統計軟件sasv8中的anova程序進行分析，duncan’smultiple-range檢驗方法判定處理間的差異顯著性，當p<0.05時認為差異顯著。
八、胚胎后期培養液中添加gsh可顯著提高牛體外受精囊胚的發育率
選擇gsh添加濃度為0、1、3、5、7mm進行篩選，通過統計卵裂率(即，卵裂率＝受精卵裂數/受精卵數)、4-8細胞率、桑椹胚率、囊胚率(即，囊胚率＝囊胚數/卵裂胚胎數)。
結果：
胚胎后期培養液中gsh添加濃度為0、1、3、5、7mm的五組間的卵裂率和4-8細胞率均差異不顯著(p>0.05)，例如五組卵裂率均在0.80～0.88范圍內，五組4-8細胞率均在0.67～0.79范圍內；
對桑葚胚發育率(即桑椹胚率，桑葚胚率＝桑葚胚胎數/卵裂胚胎數)，3mm和5mm的gsh添加組均顯著高于對照組和5mm、7mm實驗組(p<0.05)，但3mm和5mm這兩組間差異不顯著(p>0.05)，例如對照組和5mm、7mm這三組的桑椹胚率在0.46～0.49范圍內，而3mm和5mm這兩組的桑椹胚率在0.61～0.63范圍內；
對囊胚率而言，1mm、3mm和5mm的gsh添加組均顯著高于對照組(p<0.05)，而7mm的gsh添加組與對照組間差異不顯著(p>0.05)，例如對照組和7mm組的囊胚率分別為0.32和0.36，1mm組的囊胚率為0.42，3mm和5mm組的囊胚率在0.46～0.51范圍內；這些結果與cn103898046a表1結果基本一致。可見在胚胎后期培養液中添加gsh均可提高牛ivf胚胎的體外發育率。
九、胚胎后期培養液中添加gsh可提高牛體外受精胚胎的質量
通過統計總細胞數、icm細胞數/總細胞數、凋亡率(即，凋亡率＝凋亡細胞數/總細胞數)，比較分析了gsh不同添加濃度組獲得的囊胚質量。結果如下：
對于總細胞數，1mm、3mm、5mm、7mm四個gsh濃度添加組均顯著高于對照組(p<0.05)，且3mm、5mm和7mm組均顯著高于1mm組(p<0.05)，例如0mm組總細胞數為42.4，1mm組總細胞數為63.6，3mm、5mm和7mm組總細胞數均在82～89范圍內；
對于icm細胞數/總細胞數的比率，1mm添加組與對照組差異不顯著(p>0.05)，3mm、5mm和7mm組均顯著低于對照組(p<0.05)，但這三組之間差異不顯著(p>0.05)，例如1mm添加組與對照組的icm細胞數/總細胞數比均在0.41～0.48范圍內，3mm、5mm和7mm組的icm細胞數/總細胞數比均在0.41～0.48范圍內0.27～0.34范圍內；
對于凋亡率，四個添加組與對照組之間差異不顯著(p>0.05)，1mm、3mm、7mm的gsh添加組和對照組的凋亡率均顯著低于5mm添加組(p<0.05)；這些結果與cn103898046a表2結果基本一致。可見gsh的添加有助于提高牛體外受精胚胎的質量。
十、胚胎后期培養液中添加gsh的最適添加濃度為3mm
在四個實驗組中，3mm和5mm的gsh添加組獲得的桑葚胚率和囊胚率均顯著高于對照組和其它實驗組(p<0.05)；但3mm的gsh添加組的桑葚胚率與5mm的gsh添加組間差異不顯著(p>0.05)，但囊胚率卻顯著高于5mm添加組(p<0.05)，可見3mm的gsh添加組中的牛ivf胚胎的發育率是最高的，因此gsh的最適濃度為3mm的gsh添加組。
本實施例篩選出了最適添加濃度，極大地提高了囊胚生產效率，囊胚率由30％提高至50％；對胚胎質量進行評估也顯示，添加本產品后囊胚質量也優于對照組。
實施例2：牛體外受精胚胎的培養方法
參照實施例1，不同的僅是其中的胚胎后期培養液組成改為：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
照實施例1進行試驗，結果各項指標均與實施例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相同，例如本實施例中桑葚胚率為0.633、囊胚率為0.508、凋亡率0.050。
實施例3：牛體外受精胚胎的培養方法
參照實施例1，不同的僅是其中的胚胎后期培養液組成改為：
110mm的nacl、
2.9mm的kcl、
26.5mm的nahco3、
1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
照實施例1進行試驗，結果各項指標均與實施例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相同，例如本實施例中桑葚胚率為0.636、囊胚率為0.521、凋亡率0.050。
實施例4：牛體外受精胚胎的培養方法
參照實施例1，不同的僅是其中的胚胎后期培養液組成改為：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、
枸櫞酸鈉0.04w/v％、
麥芽糖0.02w/v％、和
作為配液溶劑的水。
結果顯示，在實施例1考察的各項指標方面，本實施例4均與實施例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相同，例如本實施例4中桑葚胚率為0.634、囊胚率為0.518、凋亡率0.049；另外，在第9天時統計囊胚孵化率，結果顯示本實施例囊胚孵化率達71.6％；另外的統計發現，實施例1～3全部使用3mm谷胱甘肽的試驗中囊胚孵化率均在36～39％范圍內。
在一個補充的試驗中，參照上述實施例4，不同的僅是枸櫞酸鈉濃度改為0.03w/v％或0.05w/v％(但麥芽糖仍為0.02w/v％)，兩個試驗中各項指標均與上述實施例4基本相同，例如囊胚孵化率達70.2～71.4％范圍。在一個補充的試驗中，參照上述實施例4，不同的僅是麥芽糖濃度改為0.01w/v％或0.03w/v％(但枸櫞酸鈉仍為0.04w/v％)，兩個試驗中各項指標均與上述實施例4基本相同，例如囊胚孵化率達71.6～72.6％范圍內；這一結果表明，在胚胎后期培養液中補充添加適量枸櫞酸鈉和麥芽糖后能夠有效地提高囊胚孵化率。在一個補充的試驗中，參照上述實施例4，不同的僅是不添加枸櫞酸鈉(但麥芽糖仍為0.02w/v％)，或者不同的僅是不添加麥芽糖(但枸櫞酸鈉仍為0.04w/v％)，兩個試驗中除了囊胚孵化率以外的各項指標均與上述實施例4基本相同，但是囊胚孵化率顯著的小，均在38～40％范圍內(p<0.05，具有顯著性差異)；這一結果表明，僅添加枸櫞酸鈉和麥芽糖二者之一時不能有效提高囊胚孵化率。
實施例5：牛體外受精胚胎的培養方法
參照實施例1，不同的僅是其中的胚胎后期培養液組成改為：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
3mm的谷胱甘肽、
枸櫞酸鈉0.04w/v％、
麥芽糖0.02w/v％、和
作為配液溶劑的水。
結果顯示，在實施例1考察的各項指標方面，本實施例5均與實施例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相同，例如本實施例5中桑葚胚率為0.628、囊胚率為0.522、凋亡率0.048；另外，在第9天時統計囊胚孵化率，結果顯示本實施例囊胚孵化率達70.2％；另外的統計發現，實施例1～3全部使用3mm谷胱甘肽的試驗中囊胚孵化率均在36～39％范圍內。
在一個補充的試驗中，參照上述實施例5，不同的僅是枸櫞酸鈉濃度改為0.03w/v％或0.05w/v％(但麥芽糖仍為0.02w/v％)，兩個試驗中各項指標均與上述實施例5基本相同，例如囊胚孵化率達69.7～71.8％范圍。在一個補充的試驗中，參照上述實施例5，不同的僅是麥芽糖濃度改為0.01w/v％或0.03w/v％(但枸櫞酸鈉仍為0.04w/v％)，兩個試驗中各項指標均與上述實施例5基本相同，例如囊胚孵化率達71.8～72.4％范圍內；這一結果表明，在胚胎后期培養液中補充添加適量枸櫞酸鈉和麥芽糖后能夠有效地提高囊胚孵化率。在一個補充的試驗中，參照上述實施例5，不同的僅是不添加枸櫞酸鈉(但麥芽糖仍為0.02w/v％)，或者不同的僅是不添加麥芽糖(但枸櫞酸鈉仍為0.04w/v％)，兩個試驗中除了囊胚孵化率以外的各項指標均與上述實施例5基本相同，但是囊胚孵化率顯著的小，均在36～39％范圍內(p<0.05，具有顯著性差異)；這一結果表明，僅添加枸櫞酸鈉和麥芽糖二者之一時不能有效提高囊胚孵化率。在一個補充的試驗中，參照上述實施例5，不同的僅是不添加枸櫞酸鈉和麥芽糖，試驗中除了囊胚孵化率以外的各項指標均與上述實施例5基本相同，但是囊胚孵化率顯著的小，為31.3％(p<0.05，具有顯著性差異)；這一結果表明，在將胎牛血清濃度降至2.5v/v％的情況下如果不添加枸櫞酸鈉和麥芽糖二者時不能有效提高囊胚孵化率。在一個補充的試驗中，參照上述實施例5，不同的僅是胎牛血清濃度改為2v/v％或3v/v％，兩個試驗中各項指標均與上述實施例5基本相同，例如囊胚孵化率達70.3～71.7％范圍內；這一結果表明，在胚胎后期培養液中補充添加適量枸櫞酸鈉和麥芽糖的情況下，即使將胎牛血清濃度降至2～3v/v％的范圍時仍然能夠有效地提高囊胚孵化率，此時胎牛血清這種昂貴的試劑的用量是實施例1用量的20～30％，而增加的枸櫞酸鈉和麥芽糖的成本是非常低的。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。