本發明屬于醫藥領域。
背景技術：
鹿血系為鹿科動物的膛中血或茸血，其性熱，味甘咸，歸肝、腎二經，具有滋陰助陽、益精生津、行血祛瘀、消腫療傷等作用，系一種很名貴的中藥。自古至今就是達官顯貴及宮廷皇族治病健身的良藥，深受親睞。鹿血在民間亦廣為使用，用于治療風濕和類風濕癥。經近代動物實驗和臨床研究證實，鹿血除有以上作用外，在治療心悸、失眠、健忘、跌傷、及抗衰老等方面的療效也較為突出。同時，鹿血在中醫臨床醫學上也有著不容小覷的地位。
鹿血的含水量百分比為80％-81％，有機成分占16％-17％，無機成分占2％-4％，灰分占3％-4％。其主要有機成分是蛋白質，此外，鹿血中還含有超氧化物歧化酶(sod)、脫氫酶等具有抗衰老作用的酶類。還含有19種氨基酸、脂類、固醇類、游離脂肪酸類、磷脂類、糖脂類、多糖類以及多種激素和多種維生素。鹿血中亦含有若干種有益的微量元素及痕量元素。并且，磷酸肌酸激酶、甲羥丁酸脫氫酶和磷酸肌酸激酶覆酶和心臟機能相關。運用現代先進技術，可加工出含水量1％以下，蛋白質含量96％以上的新鮮鹿血粉，經檢測比較，在提供的生物活性物質多少方面，新鮮鹿血粉明顯優于優質鹿茸，鹿血的以上成分影響著鹿血的藥理作用。近年來，鹿血的藥用、保健價值得到了國內外的廣泛重視，對鹿產業的開發研究也不斷深入，并且，人們對天然綠色保健型食品和藥品的親睞給市場創造了很大的需求空間，為我國鹿業及相關醫藥、保健品產業的發展帶來廣闊的空間。
鹿血的主要功效
(1)治療老年人心悸：鹿心血、天冬、百合、生地、阿膠、沙參共同研磨并制成藥丸口服。
(2)治療痿吐血：將鹿血、棗仁、朱砂、研磨后與甜酒共同服用效果極佳。
治療失眠、心悸：將鹿血與黃酒同服，每日堅持飲用5-10克即可。
(4)治療幾種常見的血液病：以鹿血浸酒，制成鹿血含量為10％的鹿血酒，每日飲用，一日三次，一次10ml。對血小板和白細胞的減少、化學藥物性貧血以及再生障礙性貧血所引起的頭疼、頭暈、無力、牙齦出血及失眠等各種癥狀均有很好的療效。
(5)治療失眠癥：將鹿血與五味子等其他成分混合泡酒，每天服用，每天睡前堅持服用50毫升左右,會有效改善失眠癥，并且對無明顯失眠癥狀者會提高睡眠質量。
(6)治療陽痿、早泄、形寒肢冷、精神不振、腰酸背痛等癥狀，婦人性冷淡、頭暈、目眩、精神不振等癥：將鹿血與蛇床子、靈仙牌等配伍浸酒。每日服用，一日3次，每次10-20ml，對緩解以上癥狀有及其明顯的功效，有效率為95％。并且沒有副作用。
(7)治療風濕性以及類風濕性關節痛：用鹿血調制成百分比為15％的鹿血酒。每日堅持口服，但要注意適量。
鹿血的藥理作用
中醫的傳統理論認為，血的生理功能有二：一是營養，二是滋潤。具有良好的營養滋潤功效，在延緩衰老方面的功效，完全符合中醫養生學觀點，經常服用確可收到預防早衰、保健防老的效果。
經現代科學技術分析，鹿血要比一副標準的同質量梅花鹿二杠茸提供的生物活性物質還要多,它的多種微量元素和其它營養素比例適當,經檢測證實，鹿血蛋白質含量高達96％，富含包括色氨酸等8種人體必需氨基酸在內的19種氨基酸；含固醇類、磷脂類、多種不飽和脂肪酸、多種維生素和微量元素，特別是其中白蛋白、免疫球蛋白等的含量均高于人體正常值的幾倍至幾十倍。這些可以補充人體所需的能量，促進人體新陳代謝，保證人體正常生命活動。鹿血因所含營養成分豐富，它能迅速補充人體在運動中消耗的大量能量物質，促進代謝產物排泄，進而達到抗疲勞作用，并明顯降低運動后體內的乳酸和肌尿素氮含量。增強有氧運動能力，提高人體內臟的運動耐力，對體力勞動者及腦力勞動者的疲勞恢復效果明顯。同時，鹿血還是臨床行之有效的補虛強壯之劑，對體弱病后有較好療效。另外，鹿血中白蛋白和免疫球蛋白含量極高，服用后可明顯提高機體免疫力和抗病能力，還能顯著升高白細胞和血小板，抑制腫瘤細胞生長，對腫瘤細胞的防治效果明顯。
(1)延緩衰老
目前關于抗衰老學說的論點有很多，對其研究也較為廣泛和深入，但是仍未研究出延緩衰老的秘方。現代醫學研究證明，哺乳動物在衰老過程中，機體內的單胺氧化酶(mao)的活性升高，超氧化物歧化酶(sod)的活性下降，脂質的過氧化作用有所加強。體內的自由基(o2、h2o2)大量積累，因其為強氧化劑，所以會在體內將細胞膜的不飽和脂肪酸氧化，這就導致了脂質的過氧化，從而形成過氧化脂質(lpo)，并且其與蛋白質結合又形成了多種酶都難以分解的脂褐素，導致細胞膜失去應有的生理功能，進而導致組織及器官發生老化，代謝功能降低，睪酮的合成功能受到阻礙，使血液睪酮含量下降，導致蛋白質的合成功能降低，骨質疏松，肌肉萎縮，牙齒出現松動甚至脫落，性功能也出現不同程度的下降甚至喪失。而鹿血中的次黃嘌呤、尿喀啶和磷脂類等物質具有抑制單胺氧化酶(mao)活性的功能，減少自由基的形成。鹿血中的無機元素錳、鎂、銅及鋅是構成超氧化物歧化酶(sod)的核心成分，因而鹿血能夠激活sod酶的合成和活化，并能促進sod的合成，在合成過程中促使o2轉化成h2o2，并在谷胱甘肽由還原形轉變為氧化形的過程中將h2o2中的o2吸收，從而使h2o2還原成水。并在鹿血中維生素e的作用下，對細胞膜起到保護作用，進而增強組織及器官的各項功能。同時體內新陳代謝增強。肝、腦等組織器官中的過氧化脂質(lpo)的含量亦有所降低。又因鹿血能增加血清睪酮的含量，所以鹿血不僅在提高機體性功能及保護副性征能方面功效顯著，還在多種氨基酸及鈣、磷、銅等的參與下，大大加速了鈣的沉積，從而抑制了骨骼和牙齒的松動、脫落。所以，鹿血有延年益壽的作用。
(2)補血功能
經現代動物實驗研究證實，鹿血中的維生素e能起到保護細胞膜的作用；銅在機體內生成的銅藍蛋白能促進鐵的運輸和吸收；鐵以及多種氨基酸為血細胞的成分；維生素b6、維生素b12及鈷元素能增強骨髓的造血功能，使白細胞和血小板的數量明顯增加。并且，針對失血性貧血鹿血有較為明顯的補血作用，針對鹽酸苯肼的溶血性貧血有保護作用。
(3)抗輻射作用
經動物實驗研究證實，鹿血抗鈷60的輻射能力很強。
(4)抗疲勞作用
通過動物實驗研究證實，用鹿血灌服小鼠，可以明顯地延長小鼠的活動時間，其抗疲勞作用較為明顯。
(5)影響神經功能
通過動物實驗研究證實,給小鼠口服鹿血后，小鼠的睡眠時間出現明顯的延長現象，睡眠時間是對照組的2.5倍，從而證實鹿血對中樞神經系統有一定的抑制作用。
(6)對代謝的影響
對大鼠灌服鹿血口服液，經研究發現其對谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活性無明顯影響，從而說明鹿血口服液對動物體內的氨基酸代謝過程無顯著影響。但在研究過程發現鹿血可顯著降低lpo的含量，從而證明鹿血具有降低lpo的作用和抗氧化作用。
(7)補腎益精作用
經動物實驗和臨床研究證實，口服鹿血能提高睪丸酮的含量和機體性功能，促進性器官發育增長，鹿血能起到性激素的作用，對性功能障礙有很好的改善和治療作用。
(8)促進創傷愈合作用
鹿血中含有一種多胺類化合物，這種化合物可以激活體內rna聚合酶活性，進而促進體內蛋白質的合成，加快創傷處的肌肉再生以及傷口的愈合。鹿血中還含有鋅元素，眾所周知，機體內100多種生物酶的組成均離不開鋅元素，它能促進傷口的愈合及組織的修復再生，對人體內、外部傷口的愈合起到極大地促進作用。
活性肽類物質的研究進展
蛋白質是一切生命活動的重要物質基礎，其在生物體內的地位舉足輕重，生命活動的主要表現形式是新陳代謝，構成新陳代謝的所有化學反應都需要酶作為催化劑來進行，然而，幾乎體內所有的酶都是蛋白質，因而，生長、免疫、呼吸、消化等一切生命活動均是通過蛋白質來實現的。因此，有關蛋白質的研究一直以來倍受生物技術領域研究人員的重視。
蛋白質分子是由19種氨基酸以肽鍵的方式連接而成的大分子物質，其分子量約在幾萬到幾十萬da之間，蛋白質不僅在醫藥領域中具有重要的加工特性，而且在生物學上也具有不容忽視的生物學功能：(1)酶的催化作用：細胞內所有的生物化學反應都需要酶的參與，生物體內有上千種酶，每一種酶都催化一種化學反應，因此，任何生物體的正常運轉都依賴于酶的催化作用；(2)儲存及運輸作用：某些蛋白質有儲存及運輸氧氣、金屬離子、葡萄糖和酯類等的作用，是生物體內的必要物質；(3)防御作用：許多蛋白質可以抵抗外來物的入侵，它們能識別、沉淀或中和入侵的細菌或病毒，它們能與入侵的外來物結合，抑或將外來物包圍，致其失活；某些蛋白質還可使細胞或組織產生收縮，通過改變形狀來起到防御損傷的保護作用；(4)調節作用：有一些蛋白質能夠調節細胞活性，還有一些能夠影響細胞的生理功能，這類蛋白質中最常見的是激素蛋白。其它種類的調節蛋白能夠與脫氧核糖核酸鍵結合，調節酶與核糖核酸(rna)的生物合成反應。
生物活性肽(bioactivepeptides)是一類結構相對簡單、具有特殊生理活性的小分子蛋白物質，也即一種具有特殊生物學功能的肽。氨基酸之間彼此以酰胺鍵相互連接而成的化合物稱作肽，跟據組成氨基酸殘基數目的多少可以分為寡肽和多肽，其中含10個以上氨基酸殘基的肽稱為多肽或大肽，其分子量區間為5000～10000；含10個以下氨基酸殘基的肽稱為寡肽(或稱低聚肽、小肽)，其分子段為180～1000。由于肽的相對分子質量與蛋白質相比小很多，但其生物活性卻很高，因而也稱小肽為生物活性肽。
活性肽類物質的生理功能
生物活性肽是具有一定生理功能的肽,對機體有益，其作用主要表現在傳遞生理信息，此外，它在調節生命活動的生理功能方面也起著不容小覷的作用。總之，生物活性肽在維持人體內正常生理活動方面作用顯著。大量研究結果表明，生物活性肽不僅能提供人體生長發育所需的各類營養物質，還能夠調節體內的新陳代謝和免疫過程，也正是因為它在人體內分泌量的增多或減少，人類才會有由幼年、成年、老年到死亡的過程，因而，注射活性肽可以將人體內正常的生命周期打破，延緩衰老的速度。歷年來，科學家陸續提取出了可有效清除皮膚中超氧陰離子和羥自由基的活性肽、具有抑制血管緊張素轉化酶的活性肽以及一系列抗菌肽。
小肽將人們日常所食的各種營養物質輸送到人體的各個部位，充分發揮了其作為生物體內載體和運輸工具的功能，而且，小肽作為生物體內的神經遞質，為一些反應過程傳遞信息。小肽具有極強的活性和多樣性，可多方面對人體的生理功能進行一定的調節，從而增強人體內的生理活性。小肽能促進對人體有益的多種菌類的生長，例如，酵母菌、乳酸菌、雙岐桿菌等，小肽的該方面作用能在很大程度上影響人體對食物中營養的消化和吸收。經科學家研究發現，有些小肽除具有以上作用外，還具有蛋白質或其他組成氨基酸所沒有的對機體很重要的生理機能。
活性肽的吸收機制與氨基酸有很大差異，它們是兩種相互獨立的完全不同的吸收機制。傳統觀念認為，蛋白質先在體內被水解成為氨基酸，然后進入血液循環系統，之后被轉運至機體的各個組織、器官，以上是蛋白質參與代謝的過程，其各種生物學活性就是在此過程中得到發揮的。自從1952年研究者首次觀察到活性肽的一個特性之后，生物學界對小肽的研究便有了一個新的認識，該發現被總結為腸道能夠完整地吸收雙甘肽并將其轉運到機體的各個組織。1960年小肽能夠被完整吸收得到了證實；1984年科學家在小腸粘膜上發現了一種能夠轉運小肽的載體蛋白；1994年與1996年分別克隆出了能夠轉運小肽的ⅰ型載體蛋白和ⅱ型載體蛋白。至此，小肽能夠被腸道直接并完整吸收的觀點才被生物學家所接受。
活性肽的制備方法
活性肽是指具有生物活性的多肽，這些多肽小到只含有2個氨基酸的二肽，大到復雜的長鏈或環狀多肽。近代生物技術的發展為人們從食品蛋白質中提取特殊的活性肽提供了一定的條件，人們獲得活性肽的來源有：生物體內的各類天然活性肽(酶抑制劑、激素類等)；化學合成法(液相或固定相)；酶合成法；重組dna技術；由體內消化過程或體外水解蛋白質過程產生。
化學合成法
根據介質的狀態不同，化學合成法可分為“液相合成”和“固相合成”。液相合成法主要用于合成小分子肽，在合成多肽濃縮片段方面也較為常用，固相合成法在某些方面優于液相合成法，譬如，固相的載體有利于固定肽鏈和環化肽鏈，而且其自動化生產過程較為簡易，然而，由于相關操作過程及實驗用品在規模化生產上的局限性，截至現在，固相合成法主要在快速建立多肽庫方面有施展的空間。化學合成法的缺點是：特別在利用固相合成法時，我們要采取相關措施保護肽側鏈上的一些基因；合成過程中需要的鏈接試劑需過量，酰基載體的用量也較大；鏈接試劑有一定的毒性。
重組dna法
如果能夠建立起來一個重組dna體系，那么就可以利用廉價的原料經發酵生產出大量的活性肽，然而迄今為止，利用此法制備小分子肽的嘗試也沒有取得成功。
可控酶解法
目前，研究者們已用木瓜蛋白酶酶解鰱魚制得降血壓肽及用胰蛋白酶酶解紫貽貝制得對于病原菌botryiscinerea的抑菌率達70％以上的酶解液。然而由于目前商業用酶的來源局限性，研究者們常常要從大量的酶中進行篩選，雖然酶的專一性及原料蛋白的組成可以作為參考依據，但是這種選擇仍存在較大的隨機性。隨著酶工程技術的發展，研究者們可以根據活性肽的結構特點，利用酶工程技術來生產所需的單一種酶或復合酶系。盡管可控酶解法因其安全系數高、廉價且容易推廣成為當今研究的熱點，但酶反應體系畢竟是一個十分復雜的體系，復合酶的共同作用機制仍處于探索中。
此外，酶在水相中存在的問題也較為顯著，主要是副反應多以及許多氨基酸的衍生物在水中不穩定。而且，蛋白酶水反應會產生苦味肽，其強弱程度是決定水解物能否在食品工業中應用的關鍵因素。
直接提取法
直接提取分離法制備活性肽就是直接提取天然生物體中原有的各種原生肽類，該提取過程在很大程度上需要各種分離純化技術的參與與配合，但是，因為這種原生肽在生物體中的含量不高，所以要把其從生物體中純化出來獲得較高純度的單體化合物，較為復雜的抽提過程是避免不了的，同時，其精制過程也很復雜，這無疑會大大增加實驗成本。目前，直接提取分離法主要應用于海洋資源方面，它的最大用途是為蛋白質酶解法以及肽合成法制備活性肽提供先導化合物。
技術實現要素：
本發明涉及一種鹿血肽的制備方法及其抗疲勞作用。
本發明采取的技術方案是，包括下列步驟：
(1)、鹿血的干燥：采用噴霧干燥機，調節入口溫度180℃，出口溫度80℃，轉速為26000～30000轉/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的濃度為3％，采用堿性蛋白酶進行水解，水解的條件為：溫度53℃、時間5.5h、ph9.5、酶量1272u/g；
(3)鹿血肽的純化：膜濾
將鹿血蛋白水解液透過0.45μm微濾膜，收集一次透過液，再將一次透過液過10000d的超濾膜，收集分子量小于10000d的部分；
凝膠層析
將膜濾二次透過液，采用sephadexg-25、sephadexg-15凝膠層析反復層析，凝膠柱規格為2.0cmx120cm，緩沖液為0.1mol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉，洗脫速度為10ml/h，收集到管中，為分子量1000d的多肽。
鹿血肽在制備具有抗疲勞作用的藥物中的應用。
本發明采用小鼠抗疲勞實驗對鹿血肽進行活性研究。動物實驗表明，利用最佳水解工藝生產的多肽能顯著延長小鼠的游泳時間和低壓耐缺氧能力，肝糖原含量明顯高于對照組，血乳酸含量明顯低于對照組；表明鹿血肽具有較好的抗疲勞效果。
具體實施方式
實施例1
包括下列步驟：
(1)、鹿血的干燥：采用噴霧干燥機，調節入口溫度180℃，出口溫度80℃，轉速為26000轉/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的濃度為3％，采用堿性蛋白酶進行水解，水解的條件為：溫度53℃、時間5.5h、ph9.5、酶量1272u/g；
(3)鹿血肽的純化：膜濾
將鹿血蛋白水解液透過0.45μm微濾膜，收集一次透過液，再將一次透過液過10000d的超濾膜，收集分子量小于10000d的部分；
凝膠層析
將膜濾二次透過液，采用sephadexg-25、sephadexg-15凝膠層析反復層析，凝膠柱規格為2.0cmx120cm，緩沖液為0.1mol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉，洗脫速度為10ml/h，收集到管中，為分子量1000d的多肽。
實施例2
包括下列步驟：
(1)、鹿血的干燥：采用噴霧干燥機，調節入口溫度180℃，出口溫度80℃，轉速，轉數為28000轉/min，鹿血粉得率為10.607％；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的濃度為3％，采用堿性蛋白酶進行水解，水解的條件為：溫度53℃、時間5.5h、ph9.5、酶量1272u/g，通過五次平行實驗得到實際水解率為22.13％，與理論值相差0.33％；
(3)鹿血肽的純化：膜濾
將鹿血蛋白水解液透過0.45μm微濾膜，收集一次透過液，再將一次透過液過10000d的超濾膜，收集分子量小于10000d的部分；
凝膠層析
將膜濾二次透過液，采用sephadexg-25、sephadexg-15凝膠層析反復層析，凝膠柱規格為2.0cmx120cm，緩沖液為0.1mol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉，洗脫速度為10ml/h，收集到管中，為分子量1000d的多肽。
實施例3
包括下列步驟：
(1)、鹿血的干燥：采用噴霧干燥機，調節入口溫度180℃，出口溫度80℃，轉速為30000轉/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的濃度為3％，采用堿性蛋白酶進行水解，水解的條件為：溫度53℃、時間5.5h、ph9.5、酶量1272u/g，通過五次平行實驗得到實際水解率為22.13％，與理論值相差0.33％。
(3)鹿血肽的純化：膜濾
將鹿血蛋白水解液透過0.45μm微濾膜，收集一次透過液，再將一次透過液過10000d的超濾膜，收集分子量小于10000d的部分；
凝膠層析
將膜濾二次透過液，采用sephadexg-25、sephadexg-15凝膠層析反復層析，凝膠柱規格為2.0cmx120cm，緩沖液為0.1mol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉，洗脫速度為10ml/h，收集到管中，為分子量1000d的多肽。
鹿血肽抗疲勞活性實驗
(1)小鼠游泳實驗
表1鹿血肽對小鼠游泳時間的影響
與對照組比較：﹡p>0.05,﹡﹡p<0.01
由表1可見，與對照組相比，高劑量和中劑量組中小鼠的負重游泳時間均明顯增加(p<0.01)；低劑量組與對照組的負重游泳時間差異不明顯(p>0.05)
(2)小鼠耐低壓缺氧實驗
表2鹿血肽對小鼠耐低壓缺氧實驗的影響
與對照組比較：﹡p>0.05,﹡﹡p<0.01
由表2可見，三個高中低劑量組與空白組比較，高劑量組耐低壓缺氧能力顯著增強(p<0.01)；低、中劑量組與對照組差異不明顯(p>0.05)。
(3)小鼠肝糖原、血乳酸的測定
表3鹿血肽對小鼠肝糖原、血乳酸的影響
與對照組比較：﹡p>0.05,﹡﹡p<0.01
由表3可見，與對照組相比，高劑量組的小鼠肝糖原含量明顯增加(p<0.01)，低劑量組差異不顯著(p>0.05)；而血乳酸含量則是高劑量組均明顯低于對照組(p<0.01)，中、低劑量組差異不顯著(p>0.05)。