本發明涉及魚類dpp-iv抑制肽及其制備方法和用途，具體地說，涉及一種具有dpp-ⅳ抑制功能的魚皮蛋白肽及其制備方法與應用。
背景技術：
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖濃度以及改善其癥狀的生物活性成分。目前研究較多的天然產物類降糖因子、礦物質類降糖因子、維生素類降糖因子，其作用機理各不相同。天然產物類降糖因子按化學結構可分為黃酮類、活性多糖類、生物堿類、皂甙類、萜類、共軛亞油酸、多肽類等。自人工合成胰島素以來，磺脲類藥物、雙胍類、胰島素增敏劑、糖抑制劑等各種口服或注射的藥物相繼問世，然而化學藥物常產生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用溫和而持久，性質穩定，幾乎無毒性反應，還可多種降糖成分并存，綜合起作用等優點，備受患者以及和醫學界的青睞，成為降血糖功能因子的主要研究方向。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種具有dpp-ⅳ抑制功能的魚皮蛋白肽及其制備方法。
本發明的另一目的是提供所述魚皮蛋白肽在醫藥、食品及保健品中的應用。
為了實現本發明目的，本發明提供的具有dpp-ⅳ抑制功能的魚皮蛋白肽，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示。
含有上述魚皮蛋白肽的魚皮蛋白肽粉可按照如下方法制備，包括以下步驟：
(1)將冷凍魚皮在8-12℃條件下進行解凍清洗，魚皮清洗后用打漿機將魚皮打成漿，加入魚皮重量1.5-2.5倍的水，于125-135℃保溫30-60分鐘；
(2)將魚皮蛋白漿的溫度下調至60-70℃，進行超聲處理(超聲處理旨在改變魚皮蛋白的組織結構)；超聲處理在超聲波發生器內進行，超聲波的頻率為70-90kh，處理時間25-35分鐘；
(3)將經過超聲后魚皮蛋白漿的溫度上調至115-125℃，于115-125℃煮制150-180分鐘，然后離心取上清液；
(4)按照魚皮重量0.10-0.20％的比例向(3)的上清液中加入復合蛋白酶進行分步酶解：第一步向上清液中加入魚皮重量0.05-0.10％的復合蛋白酶i(由堿性蛋白酶和胰蛋白酶按質量比1:1-2組成，其中堿性蛋白酶的酶活為80-100萬u/g，胰蛋白酶的酶活為50-60萬u/g)，于50-65℃酶解1.0-2.0h；第二步向上述酶解體系中加入魚皮重量0.05-0.10％的復合蛋白酶ii(由菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶按質量比1:1組成，其中菠蘿蛋白酶的酶活為20-30萬u/g，風味蛋白酶的酶活為40-60萬u/g)，于55-65℃酶解1.0-2.0h；然后在95-98℃下保溫10-20分鐘，冷卻至室溫，用活性炭過濾，收集上清液；
(5)對步驟(4)所得上清液進行超濾處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的濾濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來；
(6)分子量小于3000的蛋白肽液再經過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進行分離，取第15-17分鐘收集的肽溶液；
(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到含有權利要求1所述魚皮蛋白肽的魚皮蛋白肽粉。
本發明中，rp-hplc的件為：0-5min，流動相為純水；流動相b：含0.1％tfa(三氟乙酸)的乙腈，5-10min流動相b，從0％到35％，10-15min，流動相b從65％到95％，15-30min，流動相b從95％到0％，30min停止；所用色譜柱為：kromasilc18，5μm，4.6×250mm。
本發明所用rp-hplc色譜柱為：kromasilc18，5μm，4.6×250mm。
通過lc-ms/ms對魚皮蛋白肽粉的主要成分進行測定，序列如seqidno:1和2所示的魚皮蛋白肽的含量占魚皮蛋白肽粉總重的52-55％。
本發明所述的魚皮來自鰱魚、羅非魚。
本發明還提供所述魚皮蛋白肽在藥品、保健食品和食品添加劑中的應用。
本發明進一步提供含有如seqidno:1和2所示魚皮蛋白肽的藥品、保健食品和食品。
本發明具有以下優點：
(一)本發明對魚皮進行打漿處理，然后進行125-135℃處理，再結合特定頻率超聲波技術處理魚皮蛋白漿，再進行115-125℃高溫處理，直接將可溶性蛋白提取出來。
(二)本發明先將可溶性蛋白提取出來，再利用蛋白酶酶解，蛋白酶的總使用量只為魚皮重量的0.10-0.20％。
(三)開發的產品安全，本發明采用多種食品級復合蛋白酶(堿性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶)，在溫和條件下，經過適度酶解獲得特定分子量大小的魚皮蛋白肽，無需調節ph值，產物為100％魚皮蛋白肽。
(四)所得魚皮蛋白肽中分子量小于1500da的肽的比例為90％以上。具有較好的dpp-ⅳ抑制功能，其ic50值小于0.55mg/ml。
(五)所得魚皮蛋白肽粉產品中序列如seqidno:1和2所示的魚皮蛋白肽的含量占魚皮蛋白肽粉總重的50％以上。
(六)本發明提供的魚皮蛋白肽可作為食品添加劑，廣泛用于功能食品、特需食品中。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
以下實施例中使用的堿性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶分別購自丹麥諾維信公司(堿性蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶)和南寧龐博生物工程有限公司(菠蘿蛋白酶)。
實施例1具有dpp-ⅳ抑制功能的魚皮蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍鰱魚皮100克，在12℃條件下進行解凍清洗，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚皮清洗后用打漿機將魚皮打成漿，加入魚皮重量1.5倍的水在120℃的條件下保溫60分鐘。
(2)將魚皮的溫度調整到70℃，于超聲波發生器中經超聲波(頻率為60kh)處理35分鐘，改變魚皮蛋白的組織結構。
(3)然后將魚皮的溫度調整到120℃，在120℃條件下煮制150分鐘，通過離心取上清液。
(4)按照魚皮重量0.15％的比例向(3)的上清液中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步向上清液中加入魚皮重量0.10％的復合蛋白酶(堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1，其中堿性蛋白酶的酶活為80萬u/g，胰蛋白酶的酶活為60萬u/g)，在55℃的條件下進行酶解反應1.0h；然后進行第二步酶解，向上述酶解體系中加入魚皮重量0.05％復合蛋白酶(菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1，其中菠蘿蛋白酶的酶活為20萬u/g，風味蛋白酶的酶活為40萬u/g)，在60℃條件下進行酶解反應1.0h；在95-98℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，利用活性炭過濾，收集上清液。
(5)將步驟(4)所得的上清液通過二步超濾方法進行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(6)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進行分離，取15-17分鐘收集的肽溶液。
(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚皮蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對魚皮蛋白肽的主要成分進行測定，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示，兩種魚皮蛋白肽約占魚皮蛋白肽粉總重的52.5％。其中90％以上魚皮蛋白肽的分子量小于1500da。實施例2具有抗氧化功能的魚皮蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍羅非魚皮500克，在10℃條件下進行解凍清洗，取魚皮，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚皮清洗后用打漿機將魚皮打成漿，加入魚皮重量2.0倍的水在125℃的條件下保溫60分鐘。
(2)將魚皮的溫度調整到65℃，于超聲波發生器中經超聲波(頻率為55kh)處理35分鐘，改變魚皮蛋白的組織結構。
(3)然后將魚皮的溫度調整到120℃，在120℃條件下煮制180分鐘，通過離心取上清液。
(4)按照魚皮重量0.20％的比例向(3)的上清液中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步向上清液中加入魚皮重量0.10％的復合蛋白酶(堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1，其中堿性蛋白酶的酶活為90萬u/g，胰蛋白酶的酶活為50萬u/g)，在55℃的條件下進行酶解反應0.5h；然后進行第二步酶解，向上述酶解體系中加入魚皮重量0.10％復合蛋白酶(菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1，其中菠蘿蛋白酶的酶活為30萬u/g，風味蛋白酶的酶活為50萬u/g)，在65℃條件下進行酶解反應1.0h；在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，利用活性炭過濾，收集上清液。
(5)將步驟(4)所得的上清液通過二步超濾方法進行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(6)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進行分離，取15-17分鐘收集的肽溶液。
(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚皮蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對魚皮蛋白肽的主要成分進行測定，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示，兩種魚皮蛋白肽約占魚皮蛋白肽粉總重的53.2％。其中90％以上魚皮蛋白肽的分子量小于1500da。實施例3具有具有抗氧化功能的魚皮蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍羅非魚皮1000克，在8℃條件下進行解凍清洗，取魚皮，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚皮清洗后用打漿機將魚皮打成漿，加入魚皮重量2.5倍的水在130℃的條件下保溫30分鐘。
(2)將魚皮的溫度調整到60℃，于超聲波發生器中經超聲波(頻率為50kh)處理35分鐘，改變魚皮蛋白的組織結構。
(3)然后將魚皮的溫度調整到125℃，在125℃條件下煮制150分鐘，通過離心取上清液。
(4)按照魚皮重量0.20％的比例向(3)的上清液中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步向上清液中加入魚皮重量0.10％的復合蛋白酶(堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們之間的質量比為2：1，其中堿性蛋白酶的酶活為100萬u/g，胰蛋白酶的酶活為55萬u/g)，在55℃的條件下進行酶解反應1.0h；然后進行第二步酶解，向上述酶解體系中加入魚皮重量0.10％復合蛋白酶(菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為2：1，其中菠蘿蛋白酶的酶活為25萬u/g，風味蛋白酶的酶活為60萬u/g)，在65℃條件下進行酶解反應1.0h。在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，利用活性炭過濾，收集上清液；
(5)將步驟(4)所得的上清液通過二步超濾方法進行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(6)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進行1次分離，取15-17分鐘收集的肽溶液。
(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚皮蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對魚皮蛋白肽的主要成分進行測定，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示，兩種魚皮蛋白肽約占魚皮蛋白肽粉總重的53.3％。其中90％以上魚皮蛋白肽的分子量小于1500da。
實驗例1本發明魚皮蛋白肽dpp-ⅳ抑制能力的測定試驗
試驗樣品：實施例1、實施例2、實施例3制備的魚皮dpp-ⅳ抑制能力按照如下方法進行：
將樣品用100mmol/l的tris-hcl(ph8.0)緩沖液稀釋至合適的濃度，吸取25μl樣品稀釋液與25μl底物(濃度為1.6mmol/l)混合，加入到96孔酶標板中。在37℃下孵育10min后，加入50μldpp-iv酶液(酶活力為8u/l)，混勻后在37℃下精確孵育60min，立即加入100μl1mol/l的醋酸-醋酸鈉(ph4.0)緩沖液終止反應，于405nm下測吸光值a，并根據下列公式計算樣品的dpp-iv抑制率。
dpp-iv抑制率％＝{1-(a樣品-a樣品空白對照)/(a陰性對照-a陰性空白對照)}×100
a樣品：為樣品反應液在405nm處的吸光值a；
a樣品空白對照：以tris-hcl緩沖液代替dpp-iv酶液作為樣品空白對照的吸光值a；
a陰性對照：以tris-hcl緩沖液代替樣品作為陰性對照的吸光值；
a陰性空白對照：以tris-hcl緩沖液代替dpp-iv酶液和樣品作為陰性空白對照的吸光值。
dpp-iv抑制的ic50值測定：
測定樣品在不同濃度下的dpp-iv抑制率，以多肽濃度的對數值與抑制率做回歸曲線，得到回歸方程，由此計算ic50，即50％的dpp-iv酶活性抑制時肽的濃度。結果見表1。
表1本發明魚皮蛋白肽的dpp-iv抑制試驗結果
實驗例2本發明魚皮蛋白肽抗氧化活性的測定試驗
試驗樣品：樣品1、2、3分別為實施例1、實施例2、實施例3制備的魚皮蛋白肽。
按照如下方法進行：
(1)清除dpph自由基能力：取20μg/ml的魚皮蛋白肽1.5ml，加入99.5％乙醇1.5ml和含0.02％dpph的乙醇溶液0.675ml，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測體系吸光值。吸光值越低，體系清除dpph自由基的能力越強。空白對照是將樣品溶液1.5ml換成去離子水1.5ml。
dpph自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)還原力測定：取20μg/ml的魚皮蛋白肽1ml，加入0.2m磷酸緩沖液(ph6.6)2.5ml和1％(質量百分數)的鐵氰化鉀溶液2.5ml，混勻，然后在50℃水浴中加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質量百分數)三氯乙酸(tca)溶液2.5ml，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5ml，加入去離子水2.5ml和1％(質量百分數)三氯化鐵溶液0.5ml，充分混勻，在室溫下反應10min，用700nm波長測定吸光度。還原力即可用700nm波長處吸光值表示。
從表2可以看出，本發明魚皮蛋白肽具有一定的抗氧化能力，在20μg/ml的條件下，其清除dpph自由基能力達到87％以上，還原力達到0.87以上，是一種較好的抗氧化肽。
表2本發明魚皮蛋白肽的抗氧化試驗結果
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
序列表
<110>具有dpp-ⅳ抑制功能的魚皮蛋白肽及其制備方法與應用
<120>中國農業大學
<130>khp171112773.0
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>8
<212>prt
<213>魚
<400>1
alaproargalavalpheproser
15
<210>2
<211>10
<212>prt
<213>魚
<400>2
leumetglnalagluileglugluleuarg
1510