本發明涉及一種烏奴龍膽苷a的提取方法及其制備止咳藥物的用途。
背景技術：
千百年來藏藥在解除藏族人民的疾病痛苦方面發揮著巨大作用。大花龍膽gentianaszechenyiikanitz和烏奴龍膽gentianaurnulah.smith均為常用藏藥，屬于龍膽科龍膽屬植物，主產于西藏、青海西南部，多生長在海拔3000米以上的高山草地或高山礫石帶、高山草甸及流石灘等地。以大花龍膽為主流品種的白花龍膽，應用于呼吸系統疾病已有一千多年的歷史，且療效顯著。《藏藥標準》(西藏等六省衛生局編1979)記載白花龍膽(處方名為龍膽花，藏文音譯名為榜間嘎保)功效在于清熱解毒，瀉肝膽實火，用于喉部疾病，腦膜炎、肝炎、胃炎等。以白花龍膽為君藥的十五味龍膽花丸、三味龍膽花丸和十味龍膽花丸等常用藏成藥主要用于治療肺熱咳嗽等疾病，因療效確切而行銷全國。烏奴龍膽的應用歷史也非常悠久，《月王藥診》就有記載(藏藥音譯為崗嘎穹)。《藏藥標準》謂其功效于清熱解毒，止熱瀉，用于咽喉腫痛、感冒發燒、熱性病腹瀉等。因化學成分和藥理實驗方面研究較少，大花龍膽(白花龍膽的主流品種)和烏奴龍膽的藥效物質基礎尚不明確。目前尚沒有大花龍膽化學成分的研究報道。劉艷紅等對烏奴龍膽的化學成分進行了研究(云南植物研究，1994，16(4)：417-423)，從中分離鑒定了5個環烯醚萜苷，即烏奴龍膽苷(gentioumoside)a-e，其中烏奴龍膽苷a、b和c是二聚環烯醚萜苷。本課題組對大花龍膽的化學成分進行了研究，發現烏奴龍膽苷a在大花龍膽中含量也很高，并以烏奴龍膽苷a為指標性成分分別建立了白花龍膽質量標準(宗留留等，中國中藥雜志，2015，40(10)：1872-1876)和烏奴龍膽質量標準(宗留留等，中國中藥雜志，2015，40(19)：3878-3882)。而對烏奴龍膽苷a的提取分離優化及其藥效學研究，既可闡明所建立質量標準的科學性，也利于開發新的藏藥止咳藥物。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種烏奴龍膽苷a的提取方法及其在制備止咳藥物中的用途，并通過實驗性研究，闡明該化合物的止咳作用，以便能在臨床更好應用。
本發明提供的所述烏奴龍膽苷a的分子式：c40h52o22，分子量：884.29。
所述的烏奴龍膽苷a采用如下的提取方法獲得：取大花龍膽或烏奴龍膽藥材粗粉，加10-50倍量的水，煎煮或回流提取1-3次，每次1-3小時，離心后取上清液，合并上清液全部通過大孔樹脂柱吸附；依次用水、30-35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液沖洗大孔樹脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脫流分，濃縮得40％乙醇洗脫部位；將40％乙醇洗脫部位先后經凝膠sephadexlh-20柱層析和硅膠柱層析分離，合并烏奴龍膽苷a流份，得到烏奴龍膽苷a純品。
本發明所述的烏奴龍膽苷a可以是從含烏奴龍膽苷a的各種藥材中如大花龍膽、烏奴龍膽中提取獲得烏奴龍膽苷a粗品或烏奴龍膽苷a單體化合物。
優選的，其中水提取物通過d101大孔樹脂柱洗脫，先后經凝膠sephadexlh-20柱層析(甲醇系統)和硅膠柱層析(乙酸乙酯-甲醇-水10∶1.5∶1系統)分離，合并烏奴龍膽苷a流份，得到烏奴龍膽苷a純品。
本發明的另一個目的是提供烏奴龍膽苷a在制備治療咳嗽藥物中的應用。
優選的，其中所述烏奴龍膽苷a用于治療肺熱咳嗽、感冒咳嗽。
本發明的另一個目的是提供一種治療咳嗽的藥物制劑，該制劑以烏奴龍膽苷a作為活性成分與藥學上可以接受的載體相結合制成藥學上可以接受的劑型。
藥效學實驗證明：烏奴龍膽苷a可延長由濃氨水所致實驗性小鼠咳嗽模型中小鼠的咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數，也可延長由枸櫞酸所致實驗性豚鼠咳嗽模型中豚鼠的咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數，表明烏奴龍膽苷a具備良好的止咳效果，為臨床治療咳嗽提供新的選擇，具有良好藥用開發價值。
具體實施方式
以下將對本發明的優選實施例進行詳細的描述，應當理解，優選實施例僅為了說明本發明，而不是為了限制本發明的保護范圍。
實施例1：從大花龍膽藥材中分離烏奴龍膽苷a
取大花龍膽藥材粗粉20g，加25倍量的水，加熱回流提取3次，每次1小時，離心后取上清液，合并上清液，全部通過d101大孔樹脂柱吸附；依次用水、35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液沖洗大孔樹脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脫流分；將40％乙醇洗脫流分減壓濃縮干燥后得浸膏327.0mg，浸膏用甲醇溶解后采用甲醇系統經凝膠sephadexlh-20柱層析分離，收集烏奴龍膽a流份，減壓濃縮干燥后得浸膏203.7mg，再采用乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1.5∶1)系統為流動相經硅膠柱層析分離，合并烏奴龍膽苷a流份，減壓濃縮干燥后得到烏奴龍膽苷a純品119.8mg。經與文獻(劉艷紅等，云南植物研究，1994，16(4)：417-423)報道的烏奴龍膽苷a的1h-nmr、13c-nmr比較，確定為烏奴龍膽苷a結構。
實施例2：從烏奴龍膽藥材中分離烏奴龍膽苷a
取烏奴龍膽藥材粗粉20g，加25倍量的水，加熱回流提取3次，每次1小時，離心后取上清液，合并上清液全部通過d101大孔樹脂柱吸附；依次用水、35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液沖洗大孔樹脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脫流分；將40％乙醇洗脫流分減壓濃縮干燥后得浸膏142.0mg，浸膏用甲醇溶解后采用甲醇系統經凝膠sephadexlh-20柱層析分離，收集烏奴龍膽a流份，減壓濃縮干燥后得浸膏81.6mg，再采用乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1.5∶1)系統為流動相經硅膠柱層析分離，合并烏奴龍膽苷a流份，減壓濃縮干燥后得到烏奴龍膽苷a純品33.2mg。經與文獻(劉艷紅等，云南植物研究，1994，16(4)：417-423)報道的烏奴龍膽苷a的1h-nmr、13c-nmr比較，確定為烏奴龍膽苷a結構。
實施例3：對濃氨水所致的小鼠咳嗽的影響
(1)實驗動物icr小鼠，雌雄各半，清潔級，20±2g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：scxk(滬)2013-0016。
(2)試藥與儀器25％濃氨水(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸可待因片(30mg/片，中國醫藥工業有限公司，批號：20130401)；402ai型超聲波霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)；陽性藥磷酸可待因片的人最大日用量為8片(30mg/片)，小鼠等效換算劑量為30mg/kg；烏奴龍膽苷a的給藥劑量參照陽性藥給藥劑量，高、中、低劑量分別為60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg。
(3)實驗方法采用隨機區組設計方法，考慮性別和體重的組間均衡性，分成5組，每組10只。實驗前小鼠禁食不禁水12h，然后各組小鼠按0.2ml/10g灌胃給藥，1次/天，每天同一時間灌胃，連續3天。末次給藥1h后將各組小鼠逐只放入1l密閉燒杯內，用超聲霧化器以一固定霧量向內噴25％濃氨水5s后，保持密閉環境，觀察并記錄小鼠咳嗽潛伏期和2min內的咳嗽次數，每組實驗完后更換新的25ml濃氨水。運用spss18.0統計軟件對數據進行統計分析。
(4)實驗結果
表1烏奴龍膽苷a對濃氨水所致小鼠咳嗽的影響
備注：與空白組比較：*為p＜0.05，**為p＜0.01，***為p＜0.001
(5)實驗結論與空白組比較，烏奴龍膽苷a高、中劑量組均能延長濃氨水所致小鼠咳嗽的潛伏期(p＜0.05)，烏奴龍膽苷a高、中、低劑量組均能明顯縮短濃氨水所致小鼠咳嗽的次數(p＜0.05)。可以認為烏奴龍膽苷a具有明顯的止咳效果。
實施例4：對枸櫞酸所致的豚鼠咳嗽的影響
(1)實驗動物豚鼠，200±50g，清潔級，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：scxk(滬)2012-0008。
(2)試藥與儀器磷酸可待因片(30mg/片，中國醫藥工業有限公司，批號：20130401)；402ai型超聲波霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)；枸櫞酸(分析純，上海潤捷化學試劑有限公司，批號：20150701)；陽性藥磷酸可待因片的人最大日用量為8片(30mg/片)，豚鼠的等效劑量為20mg/kg；烏奴龍膽苷a的給藥劑量參照陽性藥給藥劑量，高、中、低劑量分別為40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg。
(3)實驗方法用17.5％枸櫞酸水溶液噴霧篩選出咳嗽敏感豚鼠，雌雄各半。置于口朝上的4l玻璃鐘罩內，蓋好蓋子形成密封可視容器，上端接通超聲霧化器以最大霧量噴霧15s，5min鐘內咳嗽次數10-30次為哮喘敏感。采用隨機區組設計方法，考慮性別和體重的組間均衡性，將篩選哮喘敏感豚鼠分成5組，每組8只。實驗前豚鼠禁食不禁水6h，然后各組豚鼠按1ml/200g灌胃給藥，1次/天，每天同一時間灌胃，連續3天。末次給藥1h后以最大霧量噴霧15s，記錄5min內豚鼠咳嗽次數。每組完后更換新的25ml17.5％枸櫞酸水溶液。運用spss18.0統計軟件對數據進行分析。
(4)實驗結果
表2烏奴龍膽苷a對枸櫞酸所致豚鼠咳嗽的影響
備注：與空白組比較：*為p＜0.05，**為p＜0.01，***為p＜0.001
(5)實驗結論與空白組比較，烏奴龍膽苷a高、中、低劑量組均能明顯縮短濃氨水所致豚鼠咳嗽的咳嗽潛伏期和咳嗽次數(p＜0.05)。可以認為烏奴龍膽苷a具有明顯的止咳效果。
以上所述僅為本發明的優選實施例，只用于對本發明技術方案做進一步詳細說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據本發明的上述內容作出的一些非本質的改進和調整均屬于本發明的保護范圍。