青光眼診斷分子標記物lncRNAsT267384、試劑盒及應用的制作方法

技術領域:

本發明涉及分子診斷技術領域，具體涉及一種有助于青光眼診斷的長鏈非編碼rna標志物、試劑盒及應用。

背景技術：
:

眼睛是人體十分重要的感覺器官，能夠接受外部的光刺激，并將光沖動傳送到大腦中樞而引起視覺。達芬奇曾說：“眼睛是心靈的窗戶，通過眼睛，人們得以擁抱和欣賞世界的無限美妙，靈魂才得以安居于體內”。信息時代，人通過感覺器官從外界獲得的信息中，大約90％是由眼睛來完成的。世界衛生組織的資料顯示，眼科疾病已成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第三位危害及影響人們生存質量的疾病。在所有眼科疾病中，青光眼則是首位不可逆轉的致盲性眼病，其影響視覺質量的原因是通過威脅和損害視神經及其通路而導致失明，從而嚴重威脅人類的視覺健康，給個人、家庭和社會造成難以估量的損失。

青光眼造成的主要危害是影響視覺功能，即便是在發達國家中，也只有50％左右的青光眼患者能夠得到及時的診斷和治療，而且，青光眼的發病因素、遺傳學規律等均不明了，因此我們要科學地掌握其發生發展規律，從而進行早期診斷和早期治療，避免青光眼患者的失明。目前，青光眼的診斷主要是依靠病史、形態學和功能學方面的檢查，如眼壓測量、超聲生物顯微鏡、眼底照相、光學相干斷層掃描和視野檢查等。雖然這些檢查可以診斷青光眼，但研究表明，通過形態學和功能學手段診斷的青光眼，患者視覺功能的損害已經超過50％。而青光眼相關的生化檢查、血清學篩查及檢測標準仍處于相對空白狀態，因此尋找一種高靈敏度和高特異性的標志物對青光眼診斷和監控尤為重要。

基因組計劃研究表明，在組成人類基因組的30億個堿基對中，僅有1.5％的核苷酸序列用于蛋白質編碼，其余98.5％的基因組為非蛋白編碼序列。這些序列曾被認為是在進化過程中累積的“垃圾序列”而未予以關注，在隨后啟動的人類基因組dna元件百科全書(encyclopediaofdnaelements,encode)計劃中，研究表明75％的基因序列能夠被轉錄成rna，其中近74％的轉錄產物為非編碼rna(non-codingrnas，ncrnas)。在ncrna中，序列長度大于200個堿基的轉錄本為長鏈非編碼rnas(longnoncodingrna,lncrnas),它們由于功能的豐富性及作用機制的多樣性而備受關注。lncrnas能夠在轉錄、轉錄后和翻譯多個層面上調節蛋白編碼基因的表達，從而廣泛地參與包括細胞分化和機體發育在內的重要生命過程，其異常表達還與人類多種重大疾病的發生密切相關。

lncrna具有高度保守性及組織特異性，在腦部含量非常豐富。lncrna不僅參與了神經系統的生長發育和功能完善，使神經系統按照一定的時間順序和在一定的空間內進行生長和發育，并且參與執行神經系統的功能。lncrna通過多種機制參與到神經系統的發育及功能執行中，包括作為順式作用元件及反式作用因子參與基因印記、染色質重塑、細胞周期調控、剪接調控、mrna降解和翻譯調控等過程。因此，利用檢測lncrnas的組成及表達水平的變化來反映神經系統的生理及病理狀態是可行的手段。

房水屬于眼內容物，由睫狀體產生，經過瞳孔、小梁網等最終進入血液，且處于動態循環之中，其成分構成與眼球局部生理及病理環境密切相關。外泌體作為機體至關重要的細胞間相互交流的中介物質，包含了lncrnas、mrnas、蛋白質及脂質等。外泌體內包含的物質由于特殊保護機制能長期保持穩定狀態。因此，房水中的lncrnas等分子可以外泌體的形式傳遞細胞間的相互交流信息，并可隨房水的動態循環進入血液。因此青光眼相關的lncrnas研究具有為青光眼相關生物標志物檢測提供理論基礎的潛能。

技術實現要素：

本發明的目的之一是提供一種用于青光眼早期診斷的長鏈非編碼rna，對青光眼的發病檢測有重要意義。

用于青光眼早期診斷的分子標記物lncrnast267384，其序列如seqidno:1所示。

本發明的目的之二是提供上述分子標記物lncrnast267384的應用。檢測lncrnast267384表達水平的產品在制備青光眼早期診斷工具中的應用。

所述的檢測lncrnast267384表達水平的產品包括：通過實時熒光定量pcr檢測lncrnast267384表達水平的制劑。

用實時熒光定量pcr檢測lncrnast267384表達水平的制劑包括特異性擴增lncrnast267384的引物。

用實時熒光定量pcr檢測lncrnast267384表達水平的特異性擴增lncrnast267384的引物序列為：

f:5'-tctgggcattgaagagtgaag-3’，

r:5'-agagggatgggtacaaataagc-3’。

本發明的目的之三是提供一種用于青光眼早期診斷的試劑盒，包含檢測lncrnast267384表達水平的試劑。具體是包含通過實時熒光定量pcr檢測lncrnast267384表達水平的試劑。

所述的通過實時熒光定量pcr檢測lncrnast267384表達水平的試劑包含通過實時熒光定量pcr特異性擴增lncrnast267384的引物。

所述的通過實時熒光定量pcr檢測lncrnast267384表達水平的試劑包含一對通過實時熒光定量pcr特異性擴增lncrnast267384的引物，其引物序列為：

f:5'-tctgggcattgaagagtgaag-3’，

r:5'-agagggatgggtacaaataagc-3’。

我們運用qrt-pcr檢測方法驗證lncrnas-t267384、enst00000607393和t342877在房水、虹膜組織和血清中的表達水平并分析其在兩類房水中表達量的差異。在三種組織中，房水具有最高的診斷意義，三種lncrnas在房水中診斷青光眼的敏感性/特異性均大于90％。這種現象的可能原因是由于血-房水屏障的存在，顯著限制了血源性免疫細胞和來自全身其他部位的信號分子進入房水。因此較血清而言，房水更能特異性的代表眼部的生理及病理狀態。因此，在今后的研究中房水可能較血清具有更大的青光眼診斷價值。

對于本申請而言，申請人發現相對于對照組人群，lncrnas:t267384在青光眼患者的房水和血清中均表達上調。提示t267384是青光眼中的高表達lncrnas，是有助于青光眼診斷的生物標志物。本發明為青光眼診斷提供了強有力的分子生物學基礎，具有深遠的臨床意義和推廣性。

附圖說明

圖1為青光眼患者房水中lncrnas和mrnas表達譜；

a：青光眼患者房水中lncrnas表達譜分析聚類圖；b：青光眼患者房水中mrnas表達譜分析聚類圖。

圖2為青光眼患者房水中差異表達的lncrnas和mrnas；

a：較年齡相關性白內障而言，青光眼患者房水中2倍差異表達的lncrnas；b：較年齡相關性白內障而言，青光眼患者房水中2倍差異表達的mrnas。

圖3為青光眼患者房水中lncrnas和mrnas表達的cnc分析圖；

紅色點代表lncrnas，藍色點代表mrnas，實線代表正相關，虛線代表負相關。

圖4為lncrnas在青光眼及年齡相關性白內障患者房水中的表達量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼及年齡相關性白內障患者房水中表達的散點圖；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼及年齡相關性白內障患者房水中表達的箱圖。

圖5為lncrnas在青光眼患者對照人群虹膜組織中的表達量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者及對照人群虹膜組織中表達的散點圖；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者對照人群虹膜組織中表達的箱圖。

圖6為lncrnas在青光眼患者及對照人群血清中的表達量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者及對照人群血清中表達的散點圖；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者對照人群血清中表達的箱圖。

圖7為利用lncrnas在不同組織中診斷青光眼的roc曲線；

a：利用t267384在房水中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.998；b：利用enst00000607393在房水中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.998；c：利用t342877在房水中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.983；d：利用enst00000607393在虹膜組織中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.793；e：利用t267384在血清中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.620；f：利用enst00000607393在血清中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.638。

具體實施方式

以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。

實施例1：青光眼患者房水中lncrnas及mrnas的表達譜：

1.1材料與試劑

1.1.1主要儀器

常用離心機及低溫離心機購自eppendorf公司；高速離心機購自beckman公司；real-timepcr儀器購自abi公司；移液器和電動移液槍購自eppendorf公司；q5000購自quawelltechnology公司；制冰機購自sanyan公司。

1.1.2材料與試劑

不同型號的離心管及pcr管均購自axygen公司；depc水購自鼎國昌盛公司；trizol購自invitrogen公司；targetamp^tm1-roundarnaamplification試劑盒購自epicentre公司；transcriptorfirststrandcdnasynthesis試劑盒購自roche公司；quickamplabelingkit,one-color試劑盒購自agilenttechnologies公司；人lncrnasmicroarray芯片購自arraystar公司。

1.1.3試劑配置

各種免疫印跡所用試劑根據《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。

1.2方法

1.2.1房水樣本準備

該研究已通過中南大學湘雅二醫院倫理委員會審批。術前與所有研究對象簽署知情同意書，在正式手術步驟開始前利用1ml的一次性無菌注射器于角膜緣抽取未稀釋的房水標本0.1ml，立即注入高壓滅菌的0.5mlep管中，置于-80℃低溫冰箱避光保存備用。所有入選患者為在我院住院需要進行手術治療的青光眼患者和年齡相關性白內障患者。納入標準：1.原發性開角型青光眼：a.眼壓>21mmhgb.青光眼性視盤損害和/rnfl缺損c.典型的青光眼性視野缺損d.前房角開放。具有以上四項或具有其中的a,d,b或c者。2.正常眼壓性青光眼：具有類似于poag的視盤改變，rnfl及視野損害，24h眼壓測量均≤21mmhg,房角開放。3.原發性閉角型青光眼：具有青光眼的視盤改變，rnfl及視野損害，眼壓>21mmhg,前房角變窄或關閉4.年齡相關性白內障(對照組)：晶狀體呈皮質性和/或核型渾濁和/或后囊下性混濁。排除標準：1.伴發全身性疾病如高血壓和糖尿病等。2.繼發性青光眼3.可能影響視野、視神經或色覺的眼科或神經科疾病。4.視野檢測可靠性標準：固視丟失率、假陽性率和/或假陰性率>25％。5.年齡相關性白內障：排除并發性、外傷性、先天性白內障并排除伴有其他眼內疾病者、排除過熟期病例。

1.2.2rna提取

取房水0.1ml加入0.5mltrizol試劑，劇烈震蕩后加入0.1毫升氯仿。而后經離心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于10微升dpec水，經q5000儀器測量各管rna濃度。

1.2.3rna擴增

使用targetamp^tm1-roundarnaamplificationkit103(epicentre)按生廠商說明書所示步驟對rna進行擴增。大致步驟如下：首先根據rna樣本合成單成單鏈cdna:rna雜交產物，然后使用rnaseh酶將上述雜交產物消化為小片段序列，這些小片段序列可協助雙鏈cdna的合成。最后由雙鏈cdna轉錄合成反義rna。

1.2.4cdna合成和標記

使用transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit(roche)按生廠商說明書所示步驟合成cdna。使用quickamplabelingkit,one-color(agilenttechnologies)對合成的cdna進行標記。

1.2.5標記效率質量檢測

取1.5微升已標記的cdna樣本，使用nanodropnd-1000檢測熒光標記效率。

1.2.6芯片雜交

在標準條件下將標記好的探針和高密度芯片(humanlncrnamicroarrayv4.0,arraystar公司)進行雜交。該芯片共檢測40173種lncrnas及20730種mrnas表達水平。

1.2.7圖像采集和數據分析

使用genepix4000b芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度，并將實驗結果轉換成數字型數據保存。p值<0.05為差異有統計學意義。

1.3結果

1.3.1青光眼患者房水中lncrnas及mrnas的表達譜

在10份青光眼患者房水樣本中平均檢測到20653±569.9種lncrnas和11265±268.3種mrnas。其中，10份青光眼患者房水樣本中均檢測到的lncrnas為11728種，均檢測到的mrnas為6686種。

1.3.2青光眼患者房水中差異表達的lncrnas及mrnas

較年齡相關性白內障而言，青光眼患者房水中2倍上調表達的lncrnas為4372種，2倍下調表達的lncrnas為2602種。較年齡相關性白內障而言，青光眼患者房水中2倍上調表達的mrnas為2783種，2倍下調表達的mrnas為1617種。

1.4結果

由于其易取性、個體特異性及相對受機體其他器官影響較小的特點，房水是一種眼部疾病生物標志物相關研究的價值較大的研究對象。并且，盡管目前已有多種研究報道青光眼相關的流行病學及遺傳學危險因素，但以房水為研究對象的相關研究相對較少。因此，我們認為房水具有應用于今后青光眼相關遺傳學研究的潛能。由于取樣的限制，人源性房水樣本體積較小。為克服該問題，我們在進行芯片雜交前增加rna擴增步驟，如此以保證后續步驟的順利進行。通過使用lncrnas芯片微陣列分析方法，11728種lncrnas及6686種mrnas在10份青光眼房水樣本中均檢測到，這與年齡相關性白內障患者房水中lncrnas和mrnas表達譜具有顯著差異，因此房水中lncrnas和mrnas表達譜表現出個體特異性及疾病特異性。就我們所知，這是第一個青光眼房水相關lncrnas和mrnas表達譜研究。

實施例2：通過cnc分析明確房水中特定lncrnas與mrnas的相關性

為進一步探討青光眼患者房水中表達的lncrnas的可能功能，我們運用cnc(coding-noncodinggeneco-expression)分析明確與青光眼相關基因的mrnas表達具有顯著相關性的lncrnas。cns分析是一種通過lncrna和mrna共表達數據，將lncrna與mrna聯系起來的分析方法。通過cnc分析可以發現與某個lncrna具有相同表達模式的mrna，通過這些mrna的功能，可以將lncrna與特定信號通路或疾病狀況聯系起來，從而便于預測lncrna的功能，并揭示其作用機制。

2.1方法

挑選房水中差異表達并且與青光眼發生發展具有相關性的mrnas，將這些mrnas在不同青光眼患者房水中的表達數據求平均值；求挑選出的mrnas標準化之后的數據與青光眼患者房水中差異表達的lncrnas相關數據之間的皮爾遜相關系數(pearsoncorrelationcoefficient,pcc)與錯誤發現率(falsediscoveryrate,fdr)；挑選出pcc≥0.90并且fdr≤0.05的記錄；使用相關記錄，利用cytoscape2.8.3工具繪圖。

2.2結果

較年齡相關性白內障而言，在青光眼患者房水中差異表達且與青光眼發生發展具有相關性的mrnas為如下十種：骨形態生成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,bmp2)、室管膜相關基因1(ependyminrelated1,epdr1)、轉化生長因子β1(transforminggrowthfactorbeta1,tgfb1)、叉頭蛋白e3(forkheadboxe3,foxe3)、生長激素促分泌素受體(growthhormonesecretagoguereceptor,ghsr)、叉頭蛋白c1(forkheadboxc1,foxc1)、跨膜及卷曲螺旋結構域1(transmembraneandcoiled-coildomains1,tmco1)、ph結構域a7(pleckstrinhomologydomaincontaininga7,plekha7)、視神經蛋白(optineurin,optn)和整合素亞基β5(integrinsubunitbeta5,itgb5)。在青光眼患者房水中，與這些mrnas表達的皮爾遜相關系數大于0.9并且錯誤發現率小于0.05的lncrnas有10種。

實施例3

我們利用qrt-pcr在青光眼及年齡相關白內障患者房水中驗證實施例2中的10種lncrnas中，7種lncrnas在兩類房水中的差異表達量具有統計學差異，3種lncrnas在兩類房水中的差異表達量無統計學差異。然后選取差異表達量最顯著的3種t267384、enst00000607393和t342877，進行進一步驗證。

實施例4

我們運用qrt-pcr檢測方法驗證實施例3中差異最顯著的3種lncrnas分子在房水、虹膜組織和血清中的表達水平，并分析其在青光眼患者和正常人中表達量的差異。

4.1材料與試劑

4.1.1主要儀器

常用離心機及低溫離心機購自eppendorf公司；高速離心機購自beckman公司；real-timepcr儀器購自abi公司；移液器和電動移液槍購自eppendorf公司；q5000購自quawelltechnology公司；制冰機購自sanyan公司。

4.1.2材料與試劑

不同型號的離心管及pcr管均購自axygen公司；depc水購自鼎國昌盛公司；trizol購自invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自roche公司。

4.1.3試劑配置

各種免疫印跡所用試劑根據《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。

4.2方法

4.2.1房水、血清及虹膜樣本準備

房水樣本按1.2.1所述步驟準備。血清樣本取自青光眼患者組及健康對照組人群，其中青光眼患者的納入及排除標準同1.2.1所述，對照組血清取自與青光眼組患者年齡與性別匹配的健康人群。虹膜樣本取自青光眼患者組及對照組，其中青光眼患者的納入及排除標準同1.2.1所述，對照組虹膜樣本取自與青光眼患者年齡與性別匹配的湘雅二醫院角膜捐贈自愿者的虹膜組織。

4.2.2rna提取

0.1毫升房水或虹膜組織加入0.5毫升trizol試劑，劇烈震蕩后加入0.1毫升氯仿。而后經離心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于20微升dpec水，經q5000儀器測量各孔rna濃度。外周靜脈血靜置30分鐘后放入離心機中，在3200轉/分鐘的條件下離心10分鐘,使用滅菌的移液管取上層血清，然經由上述同樣步驟提取rna。

4.2.3qrt-pcr

根據生廠商說明書首先依賴反轉錄酶將rna反轉錄成cdna，然后用pcr方法擴增cdna，通過測定熒光強度信號實時檢測定量擴增的產物量。

4.2.2數據分析

采用spss19.0版統計學軟件進行數據處理。計量資料以中位數±四分位數間距表示，青光眼/白內障代表兩組中位數比值，比較進行mann-whitneyu檢驗。p值<0.05為差異有統計學意義。

4.3結果

為進一步擴大房水樣本量驗證相關lncrnas的表達水平并且探究特定lncrnas在青光眼患者血清及虹膜中的表達量，我們利用qrt-pcr檢測60個房水樣本(30個青光眼患者房水樣本，30個年齡與性別匹配的年齡相關性白內障患者房水標本)、50個虹膜組織(40個青光眼患者虹膜組織樣本，10個年齡與性別匹配的角膜捐贈自愿者的虹膜組織)和158個血清樣本(103個青光眼患者血清樣本，55個年齡與性別匹配的健康人群血清樣本)中t267384、enst00000607393和t342877表達水平。結果表明，在兩類房水樣本中，三種lncrnas的表達量均有統計學差異，其在青光眼患者房水中表達量依次為在年齡相關性白內障患者房水中表達量的4.4036、2.1467和2.9692倍；在兩類虹膜組織中enst00000607393的表達量具有統計學差異，其在青光眼患者虹膜組織中表達量為在對照組虹膜組織中表達量的3.3436倍，而t267384和t342877的表達量無統計學差異；在兩類血清樣本中，t267384及enst00000607393的表達量具有統計學差異，其在青光眼患者血清中表達量依次為在對照組血清中表達量的1.2878和1.5301倍，而t342877的表達量無統計學差異(表1,2,3)(圖4,5,6)。為進一步了解這三種lncrnas在不同種組織中診斷青光眼的有效性，我們利用所得數據繪制受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲線(圖7)。發現t267384、enst00000607393和t342877在房水樣本中診斷青光眼的roc曲線下面積分別為0.998、0.998和0.983。enst00000607393在虹膜組織中診斷青光眼的roc曲線下面積為0.793；t267384和enst00000607393在血清樣本中診斷青光眼的roc曲線下面積分別為0.620和0.638。當t267384、enst00000607393和t342877在房水中的診斷值設為1.5437、1.1485和2.1052時，其診斷的敏感性/特異性依次為0.967/0.967、0.967/0.967和0.967/0.900；當enst00000607393在虹膜組織中的診斷值設為0.2470時，其診斷的敏感性/特異性為0.700/0.700；當t267384和enst00000607393在血清中的診斷值設為0.7191和0.8376時，其診斷的敏感性/特異性依次為0.612/0.600和0.680/0.600。

表13種lncrnas在房水中的表達量

表23種lncrnas在虹膜組織中的表達量

表33種lncrnas在血清中的表達量

表43種lncrnas在不同組織中診斷的敏感性和特異性

sequencelisting

<110>中南大學

<120>青光眼診斷分子標記物lncrnast267384、試劑盒及應用

<130>無

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>6891

<212>dna

<213>lncrna：t267384的序列

<400>1

tatttcatcttcgcattattttcaatactgaaggtaaatttagatctctctttttttctt60

agtctggctaaaagcttgtcaattttgcttaacttttcaaaaaaccaactttttgtttca120

ttgatttttgtattgtttacttcattttaatttcatttatttctgttctgatctttatta180

tttcttctactaattttggatttggtttgctcttgttttcctaattctttaagatgcatc240

attagattgtttatttaatgtaggcactataagtttccctcttttttgatgtaggcacta300

taacgataagcttccctcttagtactgcttttgctgtatcccatagattttggtatgttg360

tgctcccattagcatttgttccaagaaatttttaaatttcttattaaaatgatccatcct420

tgagaatgatccatatgctgaggaaaagcatgtgtattccacagccattggatgaaatgt480

tccgtaattatctactggatccatttggtctattgtgcagattaagtctgatgtttcttt540

attgatttttctgcctggaagatccatccagtgctgaaagtggggtgtcgaagtctccag600

ctattattgtattggggcctaactctctctttagctcttttttttgttttgttttgtttt660

gagatggagcctggctctgttgcccagggtggagtgcagtggtatgatcttggctcactg720

caacctccgcctcccaggttcaagctattctcctgcctcagcctcccaagtagctgggat780

tacagacatgtgccaccatacccggctaattttgtatttttagtagagatagggtttctc840

catcttggtcaagctggtctcgaactcccaacctcaggtgatccacctgccttggcctcc900

ccaaagtgctgggattataggcatgagccactgcgcctggccttttttatttttttaagg960

agggggggggtctcactacattgtctaggctagactcaaactcctgggctcaagtgatcc1020

ttctgcctcgacctcctgaaatgctgtgattacaggcatgagccaccatgactggccctg1080

actgtgtattttcaaatagcctgtcttcaggctcactaattctttcttctgcttgatcaa1140

ttctgctactgaaagcctctaatgcattgttcagtatgccaattgcatttttagctctgg1200

aatctcagtttgattctttttattttaatctttttgttaaatgtatctgatataattttg1260

aattccttctctgtgttatcttgaatttcttgagtttcctcaacacagctattttgaatt1320

ctctgcctgaaaggtcacacatctctgtttctccaggattggtccctggtggctcattta1380

gttcatttgggaggtcatgttttcctggatggtgttgatgttagtaaatgttcttcagtg1440

tctgggcattgaagagtgaagtatttattgtagtcttcactgtctaggcttatttgtacc1500

catccctcttagaaaggctttccagatatttgaaagtacttggatattgtgatgtaagct1560

gtatctgatttagagagcaccccaatcccagtaacactgttttcttgcagactcatggag1620

gtactaccttgatggtcttggaaaagatccagaagaattctctgcattatcaggcagaga1680

gactcctgttccattctgttactttcttccaagcaaaaagagtctcactctccttgttct1740

gagccacataaagccggcggtggagtgacacaagcatccctgtggccaccaccactatga1800

ctgcattgggtcagacctgaagccagcacagcagtggggcttgccaaggctggctgtaac1860

cacttcctggctactgcctatgtttgctgaaggccctggggctctacaattagctggtgg1920

caaagccggccaggcctgtgtccttcccttcagagccgtgaggtcccccaggccccaggt1980

gagtccagaggtgccttttgggaatcagggactagagtaaaaaaacttggaagtctagct2040

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