一種抗酸脅迫元器件及其應用的制作方法

本發明涉及一種抗酸脅迫元器件及其應用，屬于生物工程
技術領域：
。
背景技術：
：當乳酸菌被用作工業化生產之后，在其發酵過程中，隨著菌體的代謝生長過程，酸性物質也隨之產生并積累，導致細胞面臨嚴重的酸脅迫。為維持發酵生產的穩定性并提高生產效率，工業上通常在發酵的過程中通過添加外源中和劑來維持ph處于穩定的范圍。例如通過添加堿性物質(氨水或naoh)來控制發酵環境的ph值。然而堿性物質的添加往往會導致副產物的積累。而副產物中形成的鹽類會再次導致細胞處于高滲的環境，從而造成滲透壓脅迫的產生，再次影響菌體的生長與代謝。在低ph的環境條件下，微生物細胞活性顯著降低，從而導致發酵產物的生產效率顯著下降。因此提高乳酸菌的酸脅迫耐受性對于其在發酵生產中的應用有著重要的意義。目前提高乳酸菌的酸脅迫耐受性的方法主要有：(1)誘變育種，該方法具有簡便、類型繁多等特點，但工作量大、效率低是其主要缺點；(2)生化工程策略，已有報道用過外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸脅迫耐受性，但該方法的使用造成了生產成本的增加；(3)代謝工程策略，目前利用代謝工程策略提高乳酸菌環境脅迫的方法主要包括構建新的代謝途徑、拓展已有代謝途徑和削弱已有代謝途徑。上述方法或存在成本問題，或存在成功率低的問題。技術實現要素：本發明的目的是提供一種抗酸脅迫元器件以提高乳酸乳球菌酸脅迫抗性。本發明首先提供了抗酸脅迫元器件，其氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。本發明還提供了兩株酸脅迫抗性提高的重組乳酸乳球菌，這兩株重組菌分別過量表達同源重組蛋白rect-a76和同源重組蛋白rect-mg1655。所述rect-a76的氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。所述rect-mg1655的氨基酸序列是seqidno.2所示的序列。編碼所述rect-a76的核苷酸序列，在本發明的一種實施方式中，是seqidno.3所示的序列。編碼所述rect-mg1655的核苷酸序列，在本發明的一種實施方式中，是seqidno.4所示的序列。編碼所述rect-a76的核苷酸序列，在本發明的一種實施方式中，來源于lactococcuslactisa76。編碼所述rect-mg1655的核苷酸序列，在本發明的一種實施方式中，來源于escherichiacolimg1655。所述重組菌，在本發明的一種實施方式中，宿主為乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。本發明解決還提供了一種所述重組菌的構建方法，是將編碼seqidno.1所示氨基酸序列的rect-a76基因和編碼seqidno.2所示氨基酸序列的rect-mg1655基因分別連接到表達質粒上獲得重組質粒，再分別轉化到宿主菌中獲得重組菌。所述表達質粒為pnz8148。所述宿主菌，在本發明的一種實施方式中是lactococcuslactisnz9000。所述構建方法，在本發明的一種實施方式中，具體是：將seqidno.1所示的核苷酸序列克隆到表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-a76，再將重組質粒轉化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-a76)；將seqidno.2所示的核苷酸序列克隆到表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-mg1655，再將重組質粒轉化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)。本發明還提供一種提高乳酸乳球菌酸脅迫抗性的方法，是在乳酸乳球菌中過量表達dna同源重組蛋白rect。所述方法，在本發明的一種實施方式中，rect的氨基酸序列是seqidno.1或seqidno.2所示的序列。所述方法，在本發明的一種實施方式中，具體是：將seqidno.3所示的核苷酸序列克隆到表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-a76，再將重組質粒轉化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-a76)；將seqidno.4所示的核苷酸序列克隆到表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-mg1655，再將重組質粒轉化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)，誘導表達rect。本發明還提供一種提高乳酸乳球菌乙醇脅迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸乳球菌中過量表達dna同源重組蛋白rect。所述方法，在本發明的一種實施方式中，rect的氨基酸序列是seqidno.1或seqidno.2所示的序列。所述方法，在本發明的一種實施方式中，具體是：將seqidno.3所示的核苷酸序列克隆到表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-a76，再將重組質粒轉化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-a76)；將seqidno.4所示的核苷酸序列克隆到表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-mg1655，再將重組質粒轉化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)，誘導表達rect。現有研究發現rect蛋白可顯著提高dna的同源重組效率。本發明則通過在乳酸乳球菌中過量表達rect蛋白，得到了兩株酸脅迫抗性和乙醇脅迫抗性都顯著提高的重組乳酸菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-a76)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)。在酸脅迫條件下，ph4.0脅迫3h后，重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-a76)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)的存活率分別為對照的10.5和1.4倍。在乙醇脅迫條件下，20％(v/v)乙醇脅迫6h后，重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-a76)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)的存活率分別為對照的3.7和2.1倍。附圖說明圖1：重組質粒pnz8148/rect(a76/mg1655)的結構圖；圖2：重組菌株和對照菌株的生長曲線；圖3：ph4.0條件下重組菌株與對照菌株的存活率對比；圖4：20％(v/v)乙醇脅迫條件下重組菌株與對照菌株的存活率對比。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明做更詳細的說明。實施例1重組菌株的構建從ncbi數據庫的l.lactisa76中得到如seqidno.3所示的rect-a76的基因序列，并將其克隆到乳酸乳球菌表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-a76，再將其電轉入宿主菌l.lactisnz9000中，得到重組菌株l.lactisnz9000(pnz8148/rect-a76)；從ncbi數據庫的e.colimg1655中得到如seqidno.4所示的rect-mg1655的基因序列克隆到表達質粒pnz8148上，獲得重組質粒pnz8148/rect-mg1655，再將其電轉入宿主菌l.lactisnz9000中，得到重組菌株l.lactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)。具體如下：根據rect的基因序列設計分別如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8所示的引物rect-a76-bf、rect-a76-br、rect-mg1655-bf、rect-mg1655-br(表1)，以l.lactisa76和e.colimg1655的基因組為模板pcr擴增或采用化學合成的方法，獲得seqidno.3和seqidno.4所示的基因片段。將pcr產物和載體pnz8148分別用ncoⅰ和hindⅲ雙酶切，酶切產物經純化后，進行連接。連接產物轉化大腸桿菌mc1061(商業化菌株)感受態，氯霉素平板上篩選陽性克隆，經菌落pcr驗證和酶切驗證，片段大小正確后再進行測序鑒定，最終獲得含有正確序列的重組質粒pnz8148/rect-a76和pnz8148/rect-mg1655(重組質粒結構如圖1所示)。然后從重組mc1061中提取重組質粒，電轉化l.lactisnz9000感受態細胞，氯霉素平板上篩選陽性克隆，經菌落pcr驗證和酶切驗證，片段大小正確后，最終獲得含有正確重組質粒的菌株l.lactisnz9000(pnz8148/rect-a76)和l.lactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)。電轉化條件為：1μl質粒中與40μl的感受態細胞混合，移入預冷的電轉杯中，冰上放置10min。電壓2000v，電容25μf，電阻200ω。電擊完畢后，立即向電轉杯中加入1ml含有20mmmgcl2和2mmcacl2的gm17培養基(培養基配方：m17培養基+0.5％glucose)。然后置于30℃靜置培養1.5h，涂布于含有氯霉素的gm17平板上，培養36h，挑取轉化子驗證。表1引物引物序列rect-a76-bfcatgccatggcaaatgaattaggaatctttagrect-a76-brccaagcttttagaatccctccaaaggctcttrect-mg1655-bfcatgccatggggatgactaagcaaccaccaatcgrect-mg1655-brccaagcttttattcctctgaattatcgattacact實施例2過量表達rect蛋白菌株的生長性能試驗對于考察菌株在過量表達rect蛋白時的生長情況，將菌株l.lactisnz9000(pnz8148/rect-a76)、l.lactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)和l.lactisnz9000(pnz8148)(對照)接種于加了10μg/ml氯霉素的gm17液體培養基(1ml)中進行活化，放在30℃培養箱中靜置培養過夜。再以2％的接種量將種子液轉接至新鮮的氯霉素(10μg/ml)gm17液體培養基中，30℃靜置培養。每隔2小時取樣，測定600nm波長下的od值。培養至od6000.4時加入10ng/ml的nisin誘導表達rect蛋白。以時間為橫坐標，od600值為縱坐標，繪制生長曲線。結果如圖2所示。經生長性能試驗分析，重組菌株的生物量和對照菌株沒有太大差距，說明在l.lactisnz9000中過量表達rect蛋白對菌株的生長性能沒有影響。實施例3酸脅迫條件下耐受性試驗對于考察菌株對酸的耐受性分析試驗，分別測定了重組菌株和對照菌株在ph4.0條件下的存活率。具體操作方式如下：將菌株誘導培養6h，離心收集細胞，經0.85％的生理鹽水洗滌兩次后重懸于等體積的新鮮的ph4.0(乳酸調節)的gm17(含有10μg/ml氯霉素)中，脅迫不同時間。脅迫后的菌懸液洗滌兩次后重懸于等體積的生理鹽水中，取10μl重懸液，稀釋不同梯度點種于gm17氯霉素平板上測定活菌數和存活率。經耐受性實驗分析，在ph4.0的gm17中脅迫3h后，重組菌株l.lactisnz9000(pnz8148/rect-a76)和l.lactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)的存活率分別為對照的10.5和1.4倍，說明重組菌株對酸脅迫的耐受性顯著提高。實施例4乙醇脅迫條件下耐受性實驗對于考察菌株對乙醇的耐受性分析實驗，分別測定了重組菌株和對照菌株在20％(v/v)乙醇條件下的存活率。具體操作方式如下：將菌株誘導培養6h，離心收集細胞，經0.85％的生理鹽水洗滌兩次后重懸于等體積的新鮮的加了20％(v/v)無水乙醇的gm17(含有10μg/ml氯霉素)中，脅迫不同時間。脅迫后的菌懸液洗滌兩次后重懸于等體積的生理鹽水中，取10μl重懸液，稀釋不同梯度點種于gm17氯霉素平板上測定活菌數和存活率。通過實施例3和實施例4結果分析，可知在l.lactisnz9000中過量表達rect蛋白后，菌株耐酸性能和耐乙醇性能都顯著提高，在乙醇脅迫條件下，20％(v/v)乙醇脅迫6h后，重組菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-a76)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148/rect-mg1655)的存活率分別為對照的3.7和2.1倍。說明通過在l.lactisnz9000中過量表達rect蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌酸脅迫抗性和乙醇脅迫抗性。雖然本發明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。sequencelisting<110>江南大學<120>一種抗酸脅迫元器件及其應用<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>245<212>prt<213>lactococcuslactisa76<400>1metalaasngluleuglyilepheservalaspasnleuasnmetthr151015thrilelysglntyrleuaspglyglyglylysalaseraspgluglu202530leuvalleuleuileasnleucyslysglnasnasnmetasnprophe354045metlysgluvaltyrpheilelystyrglyasnglnproalaglnile505560valvalserargaspphetyrarglysargalapheglnasnproasn65707580phevalglyilegluvalglyvalilevalleuasnlysaspglyval859095leugluhisasngluglythrphelysthrhisgluglngluleuval100105110glyalatrpalaargvalhisleulysasnthrgluileprovaltyr115120125valalavalsertyraspglutyrvalglnmetlysaspglyhispro130135140asnlysmettrpthrasnlysprocysthrmetleuglylysvalala145150155160gluserglnalaleuargmetalaphehisalaglupheserglythr165170175tyrglyglugluglutyrprogluproglulysgluproarggluval180185190asnglyvallysgluproaspargalaglnilegluserpheasplys195200205gluasptyralaalaarglysileglugluleulysglulysalagln210215220proglnlysgluvalvalglugluthrglygluvalileaspgluglu225230235240proleugluglyphe245<210>2<211>269<212>prt<213>escherichiacolimg1655<400>2metthrlysglnproproilealalysalaaspleuglnlysthrgln151015glyasnargalaproalaalavallysasnseraspvalileserphe202530ileasnglnprosermetlysgluglnleualaalaalaleuproarg354045hismetthralagluargmetileargilealathrthrgluilearg505560lysvalproalaleuglyasncysaspthrmetserphevalserala65707580ilevalglncysserglnleuglyleugluproglyseralaleugly859095hisalatyrleuleupropheglyasnlysasnglulysserglylys100105110lysasnvalglnleuileileglytyrargglymetileaspleuala115120125argargserglyglnilealaserleuseralaargvalvalargglu130135140glyaspglupheserpheglupheglyleuaspglulysleuilehis145150155160argproglygluasngluaspalaprovalthrhisvaltyralaval165170175alaargleulysaspglyglythrglnphegluvalmetthrarglys180185190glnilegluleuvalargserleuserlysalaglyasnasnglypro195200205trpvalthrhistrpgluglumetalalyslysthralaileargarg210215220leuphelystyrleuprovalserilegluileglnargalavalser225230235240metaspglulysgluproleuthrileaspproalaaspserserval245250255leuthrglyglutyrservalileaspasnsergluglu260265<210>3<211>738<212>dna<213>lactococcuslactisa76<400>3atggcaaatgaattaggaatctttagtgttgataatttaaatatgaccacaattaagcaa60tatttagatggtggtggcaaagcaagtgatgaggaacttgttttacttattaatctttgc120aaacaaaacaacatgaatccatttatgaaagaagtttatttcatcaaatatggtaatcaa180ccagctcaaatcgttgtatctcgtgacttttatcgaaaacgtgcatttcaaaatcctaat240tttgtgggtattgaagttggagtgattgtacttaacaaagatggagttcttgaacacaac300gaaggaacattcaaaactcatgaacaagaattagttggtgcatgggctagagttcattta360aaaaacacagaaatcccagtatatgttgcggtatcttatgatgaatacgttcaaatgaaa420gatggacaccctaataagatgtggactaataaaccatgtacaatgcttggaaaagtagct480gaaagccaagcactgagaatggcatttcatgctgagttttctggaacttacggagaagaa540gagtatcctgagccagaaaaagaacctcgcgaagtgaacggagtcaaagaacctgaccgt600gctcaaatcgaatcatttgataaagaggattacgcagcaagaaaaattgaagagttgaaa660gaaaaagctcaacctcaaaaagaagttgttgaagaaactggcgaagttattgatgaagag720cctttggagggattctaa738<210>4<211>810<212>dna<213>escherichiacolimg1655<400>4atgactaagcaaccaccaatcgcaaaagccgatctgcaaaaaactcagggaaaccgtgca60ccagcagcagttaaaaatagcgacgtgattagttttattaaccagccatcaatgaaagag120caactggcagcagctcttccacgccatatgacggctgaacgtatgatccgtatcgccacc180acagaaattcgtaaagttccggcgttaggaaactgtgacactatgagttttgtcagtgcg240atcgtacagtgttcacagctcggacttgagccaggtagcgccctcggtcatgcatattta300ctgccttttggtaataaaaacgaaaagagcggtaaaaagaacgttcagctaatcattggc360tatcgcggcatgattgatctggctcgccgttctggtcaaatcgccagcctgtcagcccgt420gttgtccgtgaaggtgacgagtttagcttcgaatttggccttgatgaaaagttaatacac480cgcccgggagaaaacgaagatgccccggttacccacgtctatgctgtcgcaagactgaaa540gacggaggtactcagtttgaagttatgacgcgcaaacagattgagctggtgcgcagcctg600agtaaagctggtaataacgggccgtgggtaactcactgggaagaaatggcaaagaaaacg660gctattcgtcgcctgttcaaatatttgcccgtatcaattgagatccagcgtgcagtatca720atggatgaaaaggaaccactgacaatcgatcctgcagattcctctgtattaaccggggaa780tacagtgtaatcgataattcagaggaataa810<210>5<211>32<212>dna<213>人工設計，用于pcr<400>5catgccatggcaaatgaattaggaatctttag32<210>6<211>31<212>dna<213>人工設計，用于pcr<400>6ccaagcttttagaatccctccaaaggctctt31<210>7<211>34<212>dna<213>人工設計，用于pcr<400>7catgccatggggatgactaagcaaccaccaatcg34<210>8<211>35<212>dna<213>人工設計，用于pcr<400>8ccaagcttttattcctctgaattatcgattacact35當前第1頁12