本發明屬于分子生物學領域，涉及一種采用分子生物學手段鑒定中藥的方法，具體為一種用于鑒定浙貝母的引物對及其應用。
背景技術：
：浙貝母為道地藥材“浙八味”之一，具有潤肺止咳的功效，用藥歷史悠久。貝母品種較多，除了浙貝母外，貝母主要品種還包括川貝母、湖北貝母、平貝母和伊貝母，另外流通領域還存在較多貝母偽品。不同品種的貝母藥效差異顯著，而且價格相差較大，需要建立一種準確、高效的鑒定方法。目前，較多學者利用rapd技術對浙貝母及其它藥材進行分子鑒定，但是由于rapd實驗應用的是隨機引物，導致實驗結果重復性差，無法推廣應用。中藥的基源鑒定是中藥研究工作的基礎和關鍵。品種混亂現象是目前貝母類藥材在實際應用中較難以克服的問題，而傳統的鑒別方法又有一定的主觀性，特別是對一些開花前的新鮮貝母藥材、干燥或破碎藥材，鑒定時更為困難，不僅如此，貝母屬植物種間的化學成分差異較大，用理化方法鑒定時也比較困難。核糖體dna的內轉錄間隔區基因與5srdna轉錄間隔區基因是目前研究中應用較多的序列片段之一，是被子植物進化研究中重要的dna分子標記。針對目前貝母類藥材基源混亂，部分資源短缺的狀況，為了建立有效的鑒別方法，同時了解貝母屬植物的種系關系，并從中尋找出可利用的藥用貝母資源，對貝母的樣品進行高效、準確的分子鑒定尤為重要。技術實現要素：本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種適用于浙貝母，且能夠特異性識別浙貝母的基因片段，準確、快速進行貝母品種區分的方法，本發明提供了一種用于鑒定浙貝母的引物對及其應用。技術方案：一種用于鑒定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優選的，所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對及發卡結構序列名稱序列(5’-3’)seqidno.p1-fggacagtactgggggagaagtc1p1-rgccaaatggagggtatgtgtcg2p2-fcgtaacaaggtttccgtaggtgaa3p2-rttattgatatgcttaaactcagcggg4p3-fggatccgtgcttgggcgagagtagta5p3-rggatccttagtgctggtatgatcgca6發卡結構cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在制備鑒定中藥浙貝母試劑盒中的應用。優選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩沖液。優選的，所述試劑盒鑒定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100～1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優選的，所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優選的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。有益效果：(1)本發明所述引物對能夠直接對單一樣品進行鑒定，因此該方法操作簡單、準確、應用范圍廣等優點；(2)本發明所述引物對特異性好，結果重復性好，靈敏度高，適合開發成檢測試劑盒。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑒定結果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產物鑒定結果；2為實施例2pcr產物鑒定結果；3為實施例3pcr產物鑒定結果；4～7為市售其他品種貝母。具體實施方式實施例1一種用于鑒定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在制備鑒定中藥浙貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例2一種用于鑒定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在制備鑒定中藥浙貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。實施例3一種用于鑒定浙貝母的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特異性的gc發卡結構，所述發卡結構的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在制備鑒定中藥浙貝母試劑盒中的應用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥浙貝母的步驟為：(1)提取浙貝母樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述浙貝母樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。如圖1所示，將實施例1～3的擴增產物進行電泳檢測，條帶清晰可見，產物單一。其余品種無擴增條帶。sequencelisting<110>蘇州市李良濟健康產業有限公司<120>一種用于鑒定浙貝母的引物對及其應用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1ggacagtactgggggagaagtc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gccaaatggagggtatgtgtcg22<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3cgtaacaaggtttccgtaggtgaa24<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<400>4ttattgatatgcttaaactcagcggg26<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列<400>5ggatccgtgcttgggcgagagtagta26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6ggatccttagtgctggtatgatcgca26<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當前第1頁12