一種羊肚菌屬真菌菌株菌齡的檢測方法與流程

本發明涉及食用菌領域，具體涉及一種羊肚菌屬真菌菌株菌齡的檢測方法，通過該方法能夠有效檢測羊肚菌屬真菌菌株是否老化。

背景技術：

羊肚菌是一種名貴的食用菌，近年來在我國得以大面積種植推廣，2016年的羊肚菌種植面積已達到24000畝，是2015年總面積的3倍，增速迅猛。這種快速發展的同時伴隨著菌種質量對產業造成的沖擊，每年因菌種質量問題至少造成50%的種植戶遭受重大經濟損失。

這其中，一個關鍵的問題就是羊肚菌屬真菌具有快速老化的特征，即不同菌株的菌齡差異很大。如果不慎選擇了菌齡較大的菌株，將會對生產造成重大影響。

技術實現要素：

本發明的目的就是提供一種羊肚菌屬真菌菌齡的檢測方法，通過該檢測方法，能夠準確、快速判斷菌株的菌齡，從而確定菌株是否老化，為后續的菌株篩選、復壯、培養等提供有效參考，從而為羊肚菌的栽培產業帶來巨大的經濟效益。

本發明的技術方案為：

一種羊肚菌屬真菌菌齡的檢測方法，包括以下步驟：

1）菌株活化

2）平板繼代測定或u”型管測定；

3）菌齡和菌絲生長速度計算；

4）結果分析。

其中菌株活化包括了：培養基配制、活化和平板制備；具體為：

培養基的配制：使用適宜羊肚菌菌絲培育的固體培養基；

菌株活化：將待測菌株接入固體培養基試管斜面中進行活化，待菌絲長滿試管后，待用；

平板制備：滅菌后平板在無菌條件下，倒入固體培養基，待培養基冷卻凝固后，備用。

平板繼代測定或u”型管測定具體操作為：

平板繼代測定法：平板滅菌，無菌條件下倒入培養基，待培養基冷卻后，在平板一邊，距離邊緣0.5~1cm處接種接種塊，并用接種針輕壓接種塊，使其粘附在培養基上，培養箱中培養5~7d，培養期間不定期的觀察菌落的生長情況，并定時標記菌落前端的位置，用于計算菌絲生長速度，當菌落將近生長至平板的另一邊時，用接種針朝著菌絲生長方向，切下菌落前端約0.5×1.0cm的長方形菌絲條，并保持菌絲朝向前方方向轉接如新的平板一側，使菌絲一直保持向一個方向的生長狀態；

“u”型管測定法：u型管兩端用棉塞塞緊，滅菌后使用，培養基倒入管中，使管子平放時，培養基的厚度為0.6~0.8mm；將“u”型管兩端朝上平放，至培養基冷卻凝固；將待測菌株在無菌條件下取0.5cm大小的接種塊接入“u”型管的一端，平放置于恒溫培養箱內培養，定期進行觀察，檢查菌絲生長情況，并標記菌落前端的位置，計算菌絲生長速度；待菌絲長到“u”型管的另一端培養基前端時，無菌條件下，取菌落前端，保持菌絲生長方向，轉入新的“u”型管內，繼續培養觀察。

菌齡和菌絲生長速度的具體計算標準為：

菌齡的計算：從第一代接種時間算起，直至待測菌株的生長速度迅速下降至死亡之間的時間定義為菌株的菌齡，菌齡單位為天，原代分離得到原始菌株的菌齡定義為0d。菌株的菌齡越長，作為潛在的商業推廣價值越大。

菌絲生長速度的計算：確定時間段內菌絲生長的距離，單位mm/h或cm/d。

菌齡判斷標準為：

健壯羊肚菌菌絲在固體培養基上，23℃培養，平均速度可達到0.35~0.55mm/h。衰老前的菌絲生長速度迅速下降，可在一周左右的時間，由正常的狀態縮減至0.05~0.1mm/h的生長狀態，直至最終衰老停滯生長。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：通過本判斷標準能有效的在羊肚菌栽培前對菌種質量的好壞進行檢測，已到達避免在栽培生產過程中食用菌劣質菌種，為生產帶來危害，目前在羊肚菌栽培領域還未有相關報道。

附圖說明

圖1平板法繼代培養轉接示意圖；

圖2“u”型管法繼代培養轉接示意圖；

圖3五個羊肚菌品種的菌齡及長速示意圖。

具體實施方式

實施例1

一種羊肚菌屬真菌菌齡的檢測方法，包括以下步驟：

1）菌株活化，包括：培養基配制、活化和平板制備；

培養基的配制：使用pda、cym等適宜于羊肚菌菌絲培育的固體培養基均可，以cym完全培養基為例，組成為：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸二氫鉀0.46g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，瓊脂粉20g，水1000ml，ph自然。

菌株活化：將待測菌株接入新鮮的滅過菌的固體培養基試管斜面中進行活化，培養溫度23~25℃，培養5~7d待菌絲長滿試管后，作為后續檢測的菌種使用。

平板制備：直徑9cm的平板，滅菌后使用，無菌條件下，傾倒12~15ml固體培養基，待培養基冷卻凝固后，備用。

2）平板繼代測定或u”型管測定；

平板繼代測定法，使用9cm或15cm直徑的平板，平板按照常規的滅菌操作進行滅菌，無菌條件下倒入厚度3~4mm的cym培養基，待培養基冷卻后的平板一邊，距離邊緣0.5~1cm距離處接種接種塊，并用接種針輕壓接種塊，是其粘附在培養基上，蓋上平板的蓋子，在23℃的恒溫培養箱中培養5~7d，培養期間不定期的觀察菌落的生長情況，并定時標記菌落前端的位置，用于計算菌絲生長速度，當菌落將近生長至平板的另一邊時，用接種針小心的朝著菌絲生長方向，切去下菌落前端約0.5×1.0cm的長方形菌絲條，并保持菌絲朝向前方方向轉接如新的平板一側，使菌絲一直保持向一個方向的生長狀態。

u”型管測定法，直徑18~22mm的玻璃管，長40~50cm，兩端10cm處朝同一個方向燒制彎曲30~45°（如圖2所示）。兩端用棉塞塞緊，進行高壓蒸汽滅菌后使用，將融化的固體培養基，在無菌條件下沿著管子的一端傾倒如“u”型管內，使管子平放時，培養基的厚度約0.6~0.8mm，將“u”型管兩端朝上平放，直至培養基冷卻凝固后使用。將待測菌株在無菌條件下取0.5cm大小的接種塊接入“u”型管的一端，之后平放置于恒溫培養箱內培養，定期進行觀察，檢查菌絲生長情況，并標記菌落前端的位置，計算菌絲生長速度。待菌絲長到“u”型管的另一端培養基前端時，在無菌條件下，小心的取菌落前端，保持菌絲生長方向，轉入新的“u”型管內。繼續培養觀察。

3）菌齡和菌絲生長速度計算；

菌齡的計算：從第一代接種時間算起，直至待測菌株的生長速度迅速下降至死亡之間的時間定義為菌株的菌齡，菌齡單位為天，原代分離得到原始菌株的菌齡定義為0d。菌株的菌齡越長，作為潛在的商業推廣價值越大。

菌絲生長速度的計算：確定時間段內菌絲生長的距離，單位mm/h或cm/d。

4）結果分析。

健壯羊肚菌菌絲在固體培養基上，23℃培養，平均速度可達到0.35~0.55mm/h。衰老前的菌絲生長速度迅速下降，可在一周左右的時間，由正常的狀態縮減至0.05~0.1mm/h的生長狀態，直至最終衰老停滯生長。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，對于本領域技術人員來說，在不脫離本發明原料的前提下，可以做適當的改進，這些改進也在本發明的保護范圍之內。