本發明屬于檸檬酸生產技術領域，具體地，涉及一種生物發酵法制備檸檬酸的方法。
背景技術：
檸檬酸是一種重要的有機酸，又名枸櫞酸，無色晶體，常含一分子結晶水，無臭，有很強的酸味，易溶于水。其鈣鹽在冷水中比熱水中易溶解，此性質常用來鑒定和分離檸檬酸。結晶時控制適宜的溫度可獲得無水檸檬酸。檸檬酸在工業，食品業，化妝業等具有極多的用途。廣泛應用于醫藥、化學、電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業領域。
目前我國檸檬酸發酵絕大多數采用間歇發酵的方法，發酵采用每罐按照一定的比例投入發酵培養基，并接入一定的檸檬酸菌種進行發酵培養，通過一次裝液和菌種接種發酵至終點，當發酵殘糖降低至一定程度后即判斷為發酵終點。但是采用現有技術的這種發酵方法，隨著發酵的進行，盡管檸檬酸酸度逐漸提高，殘糖逐漸降低，但是，當發酵殘糖降低到一定程度時，檸檬酸發酵菌種的代謝能力下降，致使發酵培養周期延長，且設備的利用率較低。
改進發酵培養基是縮短檸檬酸發酵周期的一個途徑，開發成本低廉，而且產酸量高的培養基，最大限度地降低企業成本是我們研究的方向。
基于上述技術問題，發展先進的酶法和化學法的水解新技術，制備高產率的碳源與可利用性氮源極有可能取得突破性進展。
高粱秸稈作為農業廢棄物，一般簡單粉碎處理或者燃燒處理，既不能充分利用，也容易造成環境污染。高粱秸稈較高的營養成分，經青貯、黃貯、氨化及糖化等處理后，可提高利用率，效益將爭更可觀。需要對高粱秸稈進行充分利用，使其具有良好的生態效益和經濟效益。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種生物發酵法制備檸檬酸的方法。
本發明提供的一種生物發酵法制備檸檬酸的方法，本發明縮短了檸檬酸發酵周期，產酸量高，同時利用高粱秸稈作為發酵基質，成本低廉。
根據本發明提供的一種生物發酵法制備檸檬酸的方法，包括如下步驟：
步驟（1）取發酵培養基原料：按照重量百分比取各原料備用，其中：高粱秸稈水解液8-12%，果糖1-4%，玉米漿提取物1-3%，貝殼粉0.02%，硫酸鈉0.02%，磷酸二氫鉀0.01%；
步驟（2）制備發酵培養基：將高粱秸稈水解液，果糖，玉米漿提取物，貝殼粉，硫酸鈉以及磷酸二氫鉀按照比例混合，攪拌均勻，然后在溫度80-100℃、維持時間15-20分鐘進行滅菌處理，再降溫至30℃，制得發酵培養基；
步驟（3）發酵制備檸檬酸：發酵菌種按照7％的接種量接入發酵培養基中，發酵42小時，得到檸檬酸發酵液。
所述發酵分連續的多階段進行，包括第一發酵階段和第二發酵階段，
在第一發酵階段中，向發酵罐中流加檸檬酸發酵培養基流加發酵菌種種子液；
提高調整培養基和種子液的流加速率，進入第二發酵階段，當發酵液中檸檬酸的酸度為大于150g/l，且殘果糖含量為1-4g/l時，停止發酵。
優選地，所述第一發酵階段發酵完成時，發酵液中的檸檬酸的酸度為50-100g/l，還果糖濃度為40-70g/l。
優選地，所述提高調整培養基和種子液的流加速率為0.6kg/小時。
優選地，所述在第一發酵階段和第二發酵階段之間補充發酵培養基。
優選地，所述高粱秸稈水解液制備方法為：將高粱秸稈粉碎，過150-200目篩，然后添加兩倍重量的濃度為10-12的氨水，220rpm攪拌水解7-9小時，最后添加鹽酸，調節溶液的ph為6.9-7.0，即可。
優選地，所述貝殼粉的細度為100-120目。
優選地，所述玉米漿提取物的制備方法為：將玉米粉碎，高溫消毒，再投入到容器中，添加兩倍重量的水浸泡1.5小時，隨后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升溫至60℃，水解45min，然后100℃滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀，即可。
優選地，所述玉米為鮮玉米。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
（1）本發明縮短了檸檬酸發酵周期，產酸量高，同時利用高粱秸稈作為發酵基質，成本低廉，開創了一條利用廢棄生物水解的碳氮源生產檸檬酸的創新技術，大大降低了成本，提高了企業利潤；
（2）本發明對高粱秸稈廢棄物進行了粉碎和水解處理，使得氮、磷、鉀、鈣、鎂以及纖維素多糖等得到有效利用；玉米含有大量的淀粉，脂肪，糖以及維生素等，但是菌株利用率較低，通過處理后，提高了各養分的浸出率，菌株利用率大大提高；
（3）本發明在發酵過程中的第一發酵階段將發酵培養基和培養成熟的發酵菌種的種子液連續流加到發酵罐中，從而達到連續發酵的目的，降低發酵周期；在所述發酵過程中的第一發酵階段以及后一個發酵階段之間選擇性地流加一定的培養基來提高檸檬酸發酵強度，提高了發酵中后期檸檬酸菌種的代謝能力，從而進一步縮短了生產周期，提高產量的目的。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
本發明提供的一種生物發酵法制備檸檬酸的方法，本發明縮短了檸檬酸發酵周期，產酸量高，同時利用高粱秸稈作為發酵基質，成本低廉。
根據本發明提供的一種生物發酵法制備檸檬酸的方法，包括如下步驟：
步驟（1）取發酵培養基原料：按照重量百分比取各原料備用，其中：高粱秸稈水解液8-12%，果糖1-4%，玉米漿提取物1-3%，貝殼粉0.02%，硫酸鈉0.02%，磷酸二氫鉀0.01%；
步驟（2）制備發酵培養基：將高粱秸稈水解液，果糖，玉米漿提取物，貝殼粉，硫酸鈉以及磷酸二氫鉀按照比例混合，攪拌均勻，然后在溫度80-100℃、維持時間15-20分鐘進行滅菌處理，再降溫至30℃，制得發酵培養基；
步驟（3）發酵制備檸檬酸：發酵菌種按照7％的接種量接入發酵培養基中，發酵42小時，得到檸檬酸發酵液。
所述發酵分連續的多階段進行，包括第一發酵階段和第二發酵階段，
在第一發酵階段中，向發酵罐中流加檸檬酸發酵培養基流加發酵菌種種子液，發酵菌種種子液由公知技術值得；
提高調整培養基和種子液的流加速率，進入第二發酵階段，當發酵液中檸檬酸的酸度為大于150g/l，且殘果糖含量為1-4g/l時，停止發酵。
優選地，所述第一發酵階段發酵完成時，發酵液中的檸檬酸的酸度為50-100g/l，還果糖濃度為40-70g/l。
優選地，所述提高調整培養基和種子液的流加速率為0.6kg/小時。
優選地，所述在第一發酵階段和第二發酵階段之間補充發酵培養基。
優選地，所述高粱秸稈水解液制備方法為：將高粱秸稈粉碎，過150-200目篩，然后添加兩倍重量的濃度為10-12的氨水，220rpm攪拌水解7-9小時，最后添加鹽酸，調節溶液的ph為6.9-7.0，即可。
優選地，所述貝殼粉的細度為100-120目。
優選地，所述玉米漿提取物的制備方法為：將玉米粉碎，高溫消毒，再投入到容器中，添加兩倍重量的水浸泡1.5小時，隨后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升溫至60℃，水解45min，然后100℃滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀，即可。
優選地，所述玉米為鮮玉米。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
（1）本發明縮短了檸檬酸發酵周期，產酸量高，同時利用高粱秸稈作為發酵基質，成本低廉，開創了一條利用廢棄生物水解的碳氮源生產檸檬酸的創新技術，大大降低了成本，提高了企業利潤；
（2）本發明對高粱秸稈廢棄物進行了粉碎和水解處理，使得氮、磷、鉀、鈣、鎂以及纖維素多糖等得到有效利用；玉米含有大量的淀粉，脂肪，糖以及維生素等，但是菌株利用率較低，通過處理后，提高了各養分的浸出率，菌株利用率大大提高；
（3）本發明在發酵過程中的第一發酵階段將發酵培養基和培養成熟的發酵菌種的種子液連續流加到發酵罐中，從而達到連續發酵的目的，降低發酵周期；在所述發酵過程中的第一發酵階段以及后一個發酵階段之間選擇性地流加一定的培養基來提高檸檬酸發酵強度，提高了發酵中后期檸檬酸菌種的代謝能力，從而進一步縮短了生產周期，提高產量的目的。
實施例1
本實施例提供的一種生物發酵法制備檸檬酸的方法，包括如下步驟：
步驟（1）取發酵培養基原料：按照重量百分比取各原料備用，其中：高粱秸稈水解液9%，果糖3%，玉米漿提取物2%，貝殼粉0.02%，硫酸鈉0.02%，磷酸二氫鉀0.01%；
步驟（2）制備發酵培養基：將高粱秸稈水解液，果糖，玉米漿提取物，貝殼粉，硫酸鈉以及磷酸二氫鉀按照比例混合，攪拌均勻，然后在溫度90℃、維持時間19分鐘進行滅菌處理，再降溫至30℃，制得發酵培養基；
步驟（3）發酵制備檸檬酸：發酵菌種按照7％的接種量接入發酵培養基中，發酵42小時，得到檸檬酸發酵液。
所述發酵分連續的多階段進行，包括第一發酵階段和第二發酵階段，
在第一發酵階段中，向發酵罐中流加檸檬酸發酵培養基流加發酵菌種種子液，發酵菌種種子液由公知技術值得；
提高調整培養基和種子液的流加速率，進入第二發酵階段，當發酵液中檸檬酸的酸度為155g/l，且殘果糖含量為4g/l時，停止發酵。
所述第一發酵階段發酵完成時，發酵液中的檸檬酸的酸度為60g/l，還果糖濃度為60g/l。
所述提高調整培養基和種子液的流加速率為0.6kg/小時。
所述在第一發酵階段和第二發酵階段之間補充發酵培養基。
所述高粱秸稈水解液制備方法為：將高粱秸稈粉碎，過170目篩，然后添加兩倍重量的濃度為11的氨水，220rpm攪拌水解7-9小時，最后添加鹽酸，調節溶液的ph為6.9，即可。
所述貝殼粉的細度為110目。
所述玉米漿提取物的制備方法為：將玉米粉碎，高溫消毒，再投入到容器中，添加兩倍重量的水浸泡1.5小時，隨后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升溫至60℃，水解45min，然后100℃滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀，即可。
所述玉米為鮮玉米。
本實施例的發酵方法與現有的間歇發酵方法相比較：
本實施例將8×105-12.5×105l的發酵培養基發酵至檸發酵液中檸檬酸的酸度為155g/l，且殘果糖含量為4g/l時，發酵所需的時間為55小時；
間歇發酵方法將同等體積相同組分的發酵培養基發酵至檸檬酸的酸度為155g/l，且殘果糖含量為4g/l時，發酵所需的時間為71小時。
實施例2
本實施例提供的一種生物發酵法制備檸檬酸的方法，包括如下步驟：
步驟（1）取發酵培養基原料：按照重量百分比取各原料備用，其中：高粱秸稈水解液12%，果糖1%，玉米漿提取物3%，貝殼粉0.02%，硫酸鈉0.02%，磷酸二氫鉀0.01%；
步驟（2）制備發酵培養基：將高粱秸稈水解液，果糖，玉米漿提取物，貝殼粉，硫酸鈉以及磷酸二氫鉀按照比例混合，攪拌均勻，然后在溫度100℃、維持時間15分鐘進行滅菌處理，再降溫至30℃，制得發酵培養基；
步驟（3）發酵制備檸檬酸：發酵菌種按照7％的接種量接入發酵培養基中，發酵42小時，得到檸檬酸發酵液。
所述發酵分連續的多階段進行，包括第一發酵階段和第二發酵階段，
在第一發酵階段中，向發酵罐中流加檸檬酸發酵培養基流加發酵菌種種子液，發酵菌種種子液由公知技術值得；
提高調整培養基和種子液的流加速率，進入第二發酵階段，當發酵液中檸檬酸的酸度為160g/l，且殘果糖含量為2g/l時，停止發酵。
所述第一發酵階段發酵完成時，發酵液中的檸檬酸的酸度為100g/l，還果糖濃度為40g/l。
所述提高調整培養基和種子液的流加速率為0.6kg/小時。
所述在第一發酵階段和第二發酵階段之間補充發酵培養基。
所述高粱秸稈水解液制備方法為：將高粱秸稈粉碎，過200目篩，然后添加兩倍重量的濃度為10的氨水，220rpm攪拌水解9小時，最后添加鹽酸，調節溶液的ph為6.9，即可。
所述貝殼粉的細度為120目。
所述玉米漿提取物的制備方法為：將玉米粉碎，高溫消毒，再投入到容器中，添加兩倍重量的水浸泡1.5小時，隨后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升溫至60℃，水解45min，然后100℃滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀，即可。
所述玉米為鮮玉米。
本實施例的發酵方法與現有的間歇發酵方法相比較：
本實施例將8×105-12.5×105l的發酵培養基發酵至檸檬酸的酸度為160g/l，且殘果糖含量為2g/l時，發酵所需的時間為54小時；
間歇發酵方法將同等體積相同組分的發酵培養基發酵至檸檬酸的酸度為160g/l，且殘果糖含量為2g/l時，發酵所需的時間為73小時。
實施例3
本實施例提供的一種生物發酵法制備檸檬酸的方法，包括如下步驟：
步驟（1）取發酵培養基原料：按照重量百分比取各原料備用，其中：高粱秸稈水解液8%，果糖4%，玉米漿提取物1%，貝殼粉0.02%，硫酸鈉0.02%，磷酸二氫鉀0.01%；
步驟（2）制備發酵培養基：將高粱秸稈水解液，果糖，玉米漿提取物，貝殼粉，硫酸鈉以及磷酸二氫鉀按照比例混合，攪拌均勻，然后在溫度80℃、維持時間20分鐘進行滅菌處理，再降溫至30℃，制得發酵培養基；
步驟（3）發酵制備檸檬酸：發酵菌種按照7％的接種量接入發酵培養基中，發酵42小時，得到檸檬酸發酵液。
所述發酵分連續的多階段進行，包括第一發酵階段和第二發酵階段，
在第一發酵階段中，向發酵罐中流加檸檬酸發酵培養基流加發酵菌種種子液，發酵菌種種子液由公知技術值得；
提高調整培養基和種子液的流加速率，進入第二發酵階段，當發酵液中檸檬酸的酸度為165g/l，且殘果糖含量為1g/l時，停止發酵。
所述第一發酵階段發酵完成時，發酵液中的檸檬酸的酸度為50g/l，還果糖濃度為70g/l。
所述提高調整培養基和種子液的流加速率為0.6kg/小時。
所述在第一發酵階段和第二發酵階段之間補充發酵培養基。
所述高粱秸稈水解液制備方法為：將高粱秸稈粉碎，過150目篩，然后添加兩倍重量的濃度為12的氨水，220rpm攪拌水解7小時，最后添加鹽酸，調節溶液的ph為7.0，即可。
所述貝殼粉的細度為100目。
所述玉米漿提取物的制備方法為：將玉米粉碎，高溫消毒，再投入到容器中，添加兩倍重量的水浸泡1.5小時，隨后添加占玉米1%重量份的α-淀粉酶，升溫至60℃，水解45min，然后100℃滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀，即可。
所述玉米為鮮玉米。
本實施例的發酵方法與現有的間歇發酵方法相比較：
本實施例將8×105-12.5×105l的發酵培養基發酵至檸檬酸的酸度為165g/l，且殘果糖含量為1g/l時，發酵所需的時間為56小時；
間歇發酵方法將同等體積相同組分的發酵培養基發酵至檸檬酸的酸度為165g/l，且殘果糖含量為1g/l時，發酵所需的時間為72小時。
以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。