長鏈非編碼RNANONHSAT113026用于腎癌診斷分子標志物的用途的制作方法

本發明涉及分子生物學
技術領域：
，具體涉及長鏈非編碼rnanonhsat113026(lncrnanonhsat113026)用于腎癌診斷分子標志物的用途。
背景技術：
：腎細胞癌是來源于腎小管上皮的惡性腫瘤，可分為腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌和嫌色細胞腎細胞癌，其中腎透明細胞癌占85～95％。腎癌發病隱匿，臨床表現不典型，要依賴影像學檢查才能發現，初期診斷率并不高，大約有30％的患者在診斷時已發生轉移，失去了手術時機。目前臨床上腎癌的早期診斷仍缺乏特異性標志物。本發現對提高腎細胞癌的診斷率和生存率，尋找高靈敏度和高特異性的腎癌診斷分子標記物有重大的臨床意義。人類基因組中僅有約2％的基因編碼蛋白質，大部分基因轉錄形成非編碼的rna(ncrnas)。其中長鏈非編碼rna(lncrnas)是一類長度大于200個核苷酸、缺少特異完整開放閱讀框、無蛋白質編碼功能的rna。lncrna參與了基因組印記、轉錄控制、轉錄后調控、蛋白功能調節等信號轉導過程中的重要環節。目前，研究發現了多種與腫瘤發生發展相關的lncrna。2012年8月28日《genomebiology》報道，斯坦福大學醫學院研究人員進行首次大型的癌癥1ncrna表達譜分析，對64個腫瘤樣品高通量rna-seq測序，在各種腫瘤類型之間找出差異表達的1065組lncrna。這表明lncrna的表達紊亂與人類的病理學進程，特別是癌變過程直接相關。因此lncrna被寄望成為腫瘤治療的重要分子靶點，解讀lncrna在腫瘤發生中的作用機制將是腫瘤研究中的新突破口。技術實現要素：本發明的目的就是針對目前臨床上，腎癌的檢測仍缺乏高靈敏度和高特異性的早期診斷指標，由此提供了lncrnanonhsat113026用于作為腎癌診斷標志物的用途。前期研究中，專利申請人采用全基因組表達譜芯片篩選技術發現了大量的腎癌相關差異表達基因，結果已發表在sci雜志medicine(2016,95(2):e2507)上。經pcr方法檢測發現，與癌旁組織比較，所有腎癌組織中lncrnanonhsat113026(序列號：nonhsag043886)表達水平顯著降低。為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：lncrnanonhsat113026用于作為腎癌診斷標志物的用途，所述長鏈非編碼rnanonhsat113026的核酸序列如seqidno.1所示。長鏈非編碼rnanonhsat113026的核酸序列為：atatataaaataaaatcactgctcagcagtagtcagtttataaaccagaatccatgagactgagttctatttcttgtgcagactgcaacagcctgaatggagtcctgcagtgtacctgtgaagacagctacacctggtttcctccctcatgccttgatccccagaactgctaccttcacacggctggagcactcccaagctgtgaatgtcatctcaacaacctcagccagagtgtcaatttctgtgagagaacaaagatttggggcactttcaaaattaatgaaaggtttacaaatgaccttttgaattcatcttctgctatatactccaaatatgcaaatggaattgaaattcaacttaaaaaagcatatgaaagaattcaaggttttgagtcggttcaggtcacccaatttcgaaatggaagcatcgttgctgggtatgaagttgttggctccagcagtgcatctgaactgctgtcagccattgaacatgttgccgagaaggctaagacagcccttcacaagctgtttccattagaagacggctctttcagagtgttcggaaaag。本發明的第二個目的是提供了檢測腎癌組織中lncrnanonhsat113026表達水平的檢測方法，所述的檢測方法為熒光定量聚合酶鏈式反應qrt-pcr，該檢測方法所需材料包括：1)用于擴增lncrnanonhsat113026的特異性引物對，所述lncrnanonhsat113026的核酸序列如seqidno.1所示；2)標準dna模板；3)pcr反應液。lncrnanonhsat113026擴增所使用的特異性引物對包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列為seqidno.2(5’-tacacctggtttcctccctcat-3’)，下游引物序列為seqidno.3(5’-aaagtgccccaaatctttgttc-3’)。lncrnanonhsat113026的檢測方法為熒光定量pcr法。本發明的有益效果為：本發明提供的長鏈非編碼rnanonhsat113026可用作腎癌診斷分子標記物，達到腎癌早診斷、早治療的用途。長鏈非編碼rna調控機制是腫瘤發病機理研究中的一個新領域，lncrnanonhsat113026在不同病理學亞型的腎癌組織和癌旁組織中均有表達，且在癌組織中的表達水平均顯著低于癌旁組織，差異具有統計學意義，提示lncrnanonhsat113026作為腎癌診斷分子標志物的可行性及臨床應用價值。lncrnanonhsat113026在腎癌不同組織學亞型中的檢測結果如下：腎透明細胞癌中，p<0.0001；腎乳頭狀細胞癌中，p<0.0001；腎嫌色細胞癌中，p＝0.0004。附圖說明圖1顯示為nonhsat113026在腎透明細胞癌組織及對應癌旁組織中的表達。圖2顯示為nonhsat113026在腎嫌色細胞癌組織及對應癌旁組織中的表達。圖3顯示為nonhsat113026在腎乳頭狀細胞癌組織及對應癌旁組織中的表達。具體實施方式實施例1：1、樣品來源：收集2012年1月至2017年1月在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院行根治性腎切除術的病例，排除有雙重癌的患者。病人術前均未接受放化療及生物治療，隨機選取83例腎透明細胞癌、10例腎嫌色細胞癌、10例腎乳頭狀細胞癌的癌組織及對應癌旁組織，所有病例的病理診斷均由兩位經驗豐富的病理科醫生核實其診斷。所有標本常規取材，新鮮組織立即置液氮中，24小時后轉移至-80℃冰箱保存備用。2、rna提取及逆轉錄：trizol法分別提取腎癌組織及癌旁組織的總rna。利用寶生物逆轉錄試劑盒進行rna的逆轉錄反應。逆轉錄體系為10μl：5×primescripttmbuffer2μl，primescriptrtenzyme0.5μl，random6mers0.5μl，totalrna2μl，rnasefreeddh2o5μl。循環體系為：37℃15min，85℃5sec，4℃。3、熒光定量pcr：通過熒光定量pcr方法檢測組織中lncrnanonhsat113026的表達水平。利用lifesybrgreen試劑盒進行逆轉錄產物的熒光定量pcr。pcr引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成，熒光定量pcr引物序列如表1所示。熒光定量體系為20μl：2×sybrgreenmix10μl，fprimer0.5μl，rprimer0.5μl，cdnaμl，ddh2o7μl。pcr循環為：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循環數為40。熒光定量pcr相對定量內參基因為gapdh。如圖1-圖3所示，以2-δct表示癌組織和癌旁組織中lncrnanonhsat113026的表達量，不同病理學亞型的腎癌與癌旁組織中lncrnanonhsat113026的表達水平差異分析采用配對t檢驗。nonhsat113026在不同病理亞型的腎癌組織與相應癌旁組織中表達水平的差異如表2所示。表1引物序列：引物名稱引物序列(5’-3’)gapdhftgacttcaacagcagcacccagapdhrcaccctgttgctgtagccaaanonhsat113026ftacacctggtttcctccctcatnonhsat113026raaagtgccccaaatctttgttc表2lncrnanonhsat113026在腎癌及癌旁組織中的表達水平差異：本發明的技術關鍵點和欲保護點：通過qrt-pcr檢測，發現在不同腎癌病理學亞型中，lncrnanonhsat113026在癌組織的表達水平均顯著低于癌旁組織，提示nonhsat113026作為腎癌診斷分子標志物的可行性及臨床應用價值。最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。<110>柳惠斌<120>長鏈非編碼rnanonhsat113026用于腎癌診斷分子標志物的用途<210>1<211>567<212>dna<213>長鏈非編碼rnanonhsat113026的核酸序列<400>1atatataaaataaaatcactgctcagcagtagtcagtttataaaccagaatccatgagac60tgagttctatttcttgtgcagactgcaacagcctgaatggagtcctgcagtgtacctgtg120aagacagctacacctggtttcctccctcatgccttgatccccagaactgctaccttcaca180cggctggagcactcccaagctgtgaatgtcatctcaacaacctcagccagagtgtcaatt240tctgtgagagaacaaagatttggggcactttcaaaattaatgaaaggtttacaaatgacc300ttttgaattcatcttctgctatatactccaaatatgcaaatggaattgaaattcaactta360aaaaagcatatgaaagaattcaaggttttgagtcggttcaggtcacccaatttcgaaatg420gaagcatcgttgctgggtatgaagttgttggctccagcagtgcatctgaactgctgtcag480ccattgaacatgttgccgagaaggctaagacagcccttcacaagctgtttccattagaag540acggctctttcagagtgttcggaaaag567<210>1<211>22<212>dna<213>上游引物序列<400>2tacacctggtttcctccctcat22<210>1<211>22<212>dna<213>下游引物序列<400>3aaagtgccccaaatctttgttc22當前第1頁12