一種具有抗氧化活性的羅非魚皮明膠肽的制備方法與流程

本發明涉及羅非魚皮明膠肽的制備方法，更具體地說，涉及一種具有抗氧化活性的羅非魚皮明膠肽的制備方法。

背景技術：

羅非魚俗名非洲鯽魚，屬鱸形目、鱺魚科，具有生長快、食物雜、抗逆性強、繁殖快、肉質好、易養殖、產量高等特點。在我國淡水養殖品種中產量提高較快。目前，羅非魚的生產加工主要以出口冷凍魚肉片為主，加工過程產生的下腳料占全魚重的60％～70％，這其中包括魚皮、魚頭、魚鰭和魚骨。這些下腳料若不進行有效利用，不但會造成極大的浪費，甚至還會對環境造成污染。合理開發和利用這些下腳料，可以有效促進羅非魚在養殖、加工產業方面的良性發展；另一方面，魚皮中含有豐富的蛋白資源且其安全性高、生物性狀良好，近年來的大量研究結果表明，從魚類資源中提取的明膠具有較好的生物相容性、生物降解性和弱抗原性，最重要的是其安全性高。另外，魚皮、魚骨、魚鱗等是魚類產品加工的主要副產物，合理地研究和開發魚類明膠，不但可以提高魚類的整體利用價值，減少環境污染，還可以拓寬各個領域所需明膠的原料來源，同時也增加了大眾對于明膠產品的選擇性，具有重要的經濟價值與理論意義。魚皮明膠經酶解制備成的明膠肽具有較高的血管緊張素轉化酶抑制作用及抗氧化、免疫調節和抗菌活性。且富含多種氨基酸，不含脂肪，能夠滿足人們對“低脂高蛋白”這一類食品的需求。魚皮中的明膠肽，可增強在低鈣水平下的骨膠原結構，進而增強骨強度，起到預防骨質疏松癥的作用，同時還可以加強皮膚中的膠原代謝的速度，達到美容的效果，此外還能夠改善與老化相關的膠原合成低下問題，對關節癥等膠原病也具有很好的預防以及治療作用。

技術實現要素：

本發明的目的在于開發一種羅非魚加工副產物——羅非魚皮再加工工藝，制備具有抗氧化活性的羅非魚皮明膠肽，提高羅非魚加工過程中副產物的利用率，避免資源浪費，提高行業額外利潤。

為達到上述目的，本發明提供了一種具有抗氧化活性的羅非魚皮明膠肽的制備方法，包括如下步驟：

s1、取羅非魚皮清洗，除雜，切碎，加入naoh溶液攪拌浸泡16～32h，浸泡期間每8h換一次溶液，水洗至ph＝7；所述naoh溶液濃度為0.1～0.2mol/l，所述羅非魚皮與所述naoh溶液的質量體積比為1g：5～10ml；

堿洗的目的是使原料中的膠原蛋白溶解，同時皂化脂肪、溶解并除去原材料中的可溶性雜蛋白，使溶解的非膠原物質在清洗時隨廢液除去。

s2、向步驟s1所述洗至中性后的魚皮中加入洗潔精水攪拌浸泡8～24h，浸泡期間每8h換一次溶液，水洗；所述洗潔精水的體積濃度為0.1～2％，所述羅非魚皮與所述洗潔精水的質量體積比為1g：5～10ml；

加入洗潔精水攪拌浸泡可以進一步去除魚皮所含的脂肪。

s3、向步驟s2所收集的魚皮中加入0.1～0.5mol/ml醋酸溶液浸提18～24h后，用200目尼龍紗布雙層濾布過濾，過濾所得沉淀水洗至ph＝7；所述羅非魚皮與所述醋酸溶液質量體積比為1g：10～20ml；

醋酸溶液浸提可以使原料充分酸化膨脹。

s4、將步驟s3所述ph＝7的沉淀復溶于水，45℃浸脹8～12h后，用whatmanno.4濾紙過濾，收集濾液凍干后即得羅非魚皮明膠；

s5、將步驟s4所述羅非魚皮明膠采用蛋白酶酶解后，于80～100℃加熱5～10min變性處理，制得羅非魚皮明膠酶解液，冷卻至室溫后3000～5000×g離心10～30min，收集上清，凍干即得羅非魚皮明膠肽。

優選方式下，步驟s1所述naoh溶液攪拌浸泡時間為24h，所述naoh溶液濃度為0.1mol/l，所述羅非魚皮與所述naoh溶液的質量體積比為1g：10ml。

優選方式下，步驟s2所述洗潔精水攪拌浸泡時間為24h，所述洗潔精水濃度為0.1～2％，所述羅非魚皮與所述洗潔精水的質量體積比為1g：8ml。

優選方式下，步驟s3所述醋酸溶液浸提時間為24h，所述醋酸溶液濃度為0.2mol/l，所述羅非魚皮與所述醋酸溶液質量體積比為1g：20ml。

優選方式下，步驟s4所述水與沉淀的體積質量比為5ml：1g；

步驟s4所述液態羅非魚皮明膠經-80℃冷凍1～3h后采用真空冷凍干燥技術干燥24～36h，凍干分3個階段進行，分別為預凍階段溫度為-50℃、冷凍時間為1h；干燥階段溫度為-50～20℃、冷凍時間為20～30h及恒溫階段溫度為20℃、冷凍時間為3～5h，預凍階段結束后抽真空，真空度設定為1～10pa。

優選方式下，步驟s5所述凍干為真空冷凍干燥，100℃加熱10min變性處理。

優選方式下，步驟s5所述酶解反應的具體操作為：

s51、采用凱式定氮法測定步驟s4制得的羅非魚皮明膠中的蛋白質含量；

s52、以水為溶劑，稱取步驟s4制得的羅非魚皮明膠制備底物濃度(以蛋白質計)為2g/100ml的羅非魚皮明膠水溶液；

s53、向步驟s52制得的羅非魚皮明膠水溶液中加入步驟s5所述蛋白酶，調節ph至6.0～8.5，37～55℃酶解0.5～3h；所述商品化的蛋白酶濃度為2000～3000(u/g底物蛋白)。

進一步優化，步驟s5所述蛋白酶包括：風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶；具體酶解條件如下，風味蛋白酶：50℃、ph＝7.0；中性蛋白酶：50℃、ph＝7.0；堿性蛋白酶：50℃、ph＝8.5；胰蛋白酶：37℃、ph＝8.0；木瓜蛋白酶：55℃、ph＝6.0。

本發明的技術創新在于：

1、與一般的有機溶劑除脂工藝的高成本、易污染環境且有害人體相比，本發明中原料除脂工藝采用家庭用洗潔精來去除魚皮中存在的脂肪，且使用濃度較低，安全無污染的同時大大降低了生產成本。

2、本發明方法涉及的操作過程簡單，無需復雜的設備，所獲得的抗氧化制品其清除羥基自由基活性(esr)最高ic50值為11±0.22mg/ml、清除dpph自由基活性最高ic50值為16±0.75mg/ml，說明以羅非魚皮為原料制備羅非魚皮明膠肽是一種有效且實用的羅非魚皮抗氧化制品的制備方法，適合工業化生產。

3、將魚皮作為原料制備成明膠肽類產品不僅使得羅非魚加工副產物變廢為寶、促進自然資源合理應用，同時也提高了行業的額外利潤，具有重要的社會和經濟價值。

附圖說明

圖1為羅非魚皮明膠水解度變化曲線。

圖2為羅非魚皮明膠水解過程中tca可溶性寡肽變化曲線。

圖3為羅非魚皮明膠肽羥基自由基清除活性(esr)。

圖4為羅非魚皮明膠肽dpph自由基清除活性。

圖5為羅非魚皮明膠肽abts自由基清除活性。

具體實施方式

實施例1

s1、取新鮮羅非魚皮，去除魚皮表面鱗片及雜質，用去離子水沖洗干凈并將其切碎；

s2、向步驟s1所述切碎后的魚皮中加入濃度為0.1mol/l氫氧化鈉溶液(魚皮質量與溶液體積比為1g：10ml)攪拌浸泡24h；

s3、步驟s2所得堿洗魚皮去離子水洗至ph為7；

s4、步驟s3所得ph7的魚皮中加入濃度為0.1～2％的洗潔精水(魚皮質量與洗潔精體積比為1g：8ml)并攪拌浸泡24h；

s5、將步驟s4中所得魚皮用去離子水清洗干凈；

s6、步驟s5中洗凈魚皮中加入濃度為0.2mol/l醋酸溶液(魚皮質量與醋酸溶液體積比為1g：20ml)浸提24h后濾布過濾，所得沉淀用去離子水洗至ph7；

s7、步驟s6中ph7的魚皮加去離子水(沉淀質量與去離子水體積比為1g：5ml)于45℃恒溫水浴浸脹8～12h；

s8、步驟s7中水浴浸脹后混合物采用whatmanno.4濾紙過濾，收集濾液真空冷凍干燥后即得羅非魚皮明膠；

s9、將s8所得羅非魚皮明膠加去離子水配成底物濃度(以蛋白質計)2g/100ml后100℃水浴中加熱10min進行變性處理，冷卻后分別以風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為工具酶，酶加量3000u/g蛋白、對羅非魚皮明膠進行酶解處理(每種酶的酶解ph及溫度如表1所示)；酶解時間分別為0.5h，1h，1.5h、2h，3h。酶解后100℃水浴滅酶10min，于4000×g下離心10min，取上清液冷凍干燥得到25種羅非魚皮明膠肽凍干粉；通過反應過程中水解度及tca可溶性寡肽含量變化綜合考量篩選最優酶解條件，得到結果如圖1和圖2所示，經五種蛋白酶水解后各原料水解度大小依次為：木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>風味蛋白酶；tca可溶性寡肽測定結果中，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶及胰蛋白酶均在酶解到60min時tca寡肽含量達到最高，其寡肽含量分別為70.99％、67.11％、56.82％和54.44％，而堿性蛋白酶酶解物在酶解120min時tca寡肽含量達最高，為56.23％。

s10、結合s9所述水解度及tca可溶性寡肽得率變化曲線，水解度及tca可溶性寡肽得率均較高時表明此時原料酶解效果較好，綜合比較選取5種酶分別酶解1h和2h制備10種羅非魚皮明膠肽原料。確定最優酶解條件：五種酶于最適酶反應條件(表1)下分別酶解1h和2h。

表1

實施例2

s1、取新鮮羅非魚皮，去除魚皮表面鱗片及雜質，用去離子水沖洗干凈并將其切碎；

s2、向步驟s1所述切碎后的魚皮中加入濃度為0.1mol/l氫氧化鈉溶液(魚皮質量與溶液體積比為1g：10ml)攪拌浸泡24h；

s3、步驟s2所得堿洗魚皮去離子水洗至ph7；

s4、步驟s3所得ph7的魚皮中加入濃度為0.1～2％的洗潔精水(魚皮質量與洗潔精體積比為1g：8ml)并攪拌浸泡24h；

s5、將步驟s4中所得魚皮用去離子水清洗干凈；

s6、步驟s5中洗凈魚皮中加入濃度為0.2mol/l醋酸溶液(魚皮質量與醋酸溶液體積比為1g：20ml)浸提24h后濾布過濾，所得沉淀用去離子水洗至ph7；

s7、步驟s6中ph7的魚皮加去離子水(沉淀質量與去離子水體積比為1g：5ml)于45℃恒溫水浴浸脹8～12h；

s8、步驟s7中水浴浸脹后混合物采用whatmanno.4濾紙過濾，收集濾液真空冷凍干燥后即得羅非魚皮明膠；

s9、將s8所得羅非魚皮明膠加去離子水配成底物濃度(以蛋白質計)2g/100ml后100℃水浴中加熱10min進行變性處理，冷卻后在最優方式下進行酶解，分別以風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為工具酶，酶加量3000u/g蛋白、對羅非魚皮明膠進行酶解處理(每種酶的酶解ph及溫度如表1所示)，酶解時間分別為1h和2h。酶解后100℃水浴滅酶10min，于4000×g下離心10min，取上清液冷凍干燥得到10種羅非魚皮明膠肽凍干粉。

s10、將s9中10種羅非魚皮明膠肽利用化學法測定其羥基(esr)、dpph及abts自由基清除活性進一步篩選出抗氧化活性較高樣品；

半抑制率(ic50)是表征物質抗氧化能力的常用指標，該指標反映了抗氧化物質提供50％抑制作用時的濃度。以羥基自由基半抑制率(ic50)的計算方法為例：首先測定不同濃度羅非魚皮明膠酶解物對羥基自由基的清除能力，以樣品濃度(mg/ml)為橫坐標，羥基清除率(％)為縱坐標，采用excel軟件做散點圖，并作回歸方程分析。通過回歸方程，計算出羥基清除率為50％時，羅非魚皮明膠酶解物的濃度，即為羥基自由基半抑制率(ic50值)。

各項抗氧化活性測定結果均以半抑制率(ic50)為指標，該數值越低說明抗氧化能力越強。綜合比較，酶解1h的樣品抗氧化活性高于2h樣品。確定5種酶酶解所得羅非魚皮明膠肽最優酶解時間為1h。不同條件下羅非魚皮明膠肽的抗氧化能力對比結果見圖3、圖4和圖5，總體上可以看出樣品羥基自由基清除活性最好，其次為dpph自由基清除活性，abts自由基清除能力最低。

圖3和圖4中羥基自由基及dpph自由基清除活性實驗結果可以得出木瓜蛋白酶酶解1h樣品抗氧化活性最強，羥基自由基清除活性ic50值為12±1.43mg/ml，與谷胱甘肽(gsh)相比僅差一個數量級，其dpph自由基清除活性ic50值為16±0.75mg/ml；其次為堿性蛋白酶酶解1h樣品，其羥基自由基清除活性ic50值為11±0.22mg/ml，與谷胱甘肽(gsh)相比僅差一個數量級，dpph自由基清除活性ic50值為33±0.02mg/ml。

圖5中樣品abts自由基清除活性測定結果表明同種酶不同酶解時間條件下，abts自由基清除活性作用并不明顯；但是可以看出不同種酶作用條件下，堿性和木瓜兩種蛋白酶酶解后樣品abts自由基清除活性活性較強。

結合圖3～5結論綜合比較最終確定最優方式下，抗氧化活性較強的兩種羅非魚皮明膠肽為堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分別酶解1h條件下所制得的樣品。

采用電子順磁共振波譜儀法(esr)測定樣品羥基自由基清除活性，儀器靈敏度高，直接測定不破壞樣品，測定結果準確可靠。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。