一株來源于蠶沙的菌株BacillussubtilisSEM?9及其應用的制作方法

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株來源于蠶沙的菌株bacillussubtilissem-9及其應用。

背景技術：

枯萎病是一種毀滅性的土傳病害，有植物“癌癥”之稱。引起該病的病原主要是鐮刀菌，寄主范圍廣泛，可引起100多種植物發生病害。長期以來，人們對病害的防治手段主要有作物輪作、選育抗病品種、化學藥物防治和生物防治等。抗病品種選育周期長且易失去抗性，化學藥物雖然具有防效高、速度快、殺蟲抗菌譜廣、成本低及使用簡單等優點，但長期使用化學藥劑易導致土質退化、病原菌產生抗藥性，造成次要病害猖獗、藥劑殘留、環境污染等嚴重生態和農產品安全問題。近年來人們對于食物安全的重視和環保意識的增強，對農業的可持續發展提出了更高的要求。生物防治因其低成本、高效率、環境友好和無藥物殘留等特點已成為當前國內外植物病害防治的研究熱點。

生物防治主要是通過拮抗微生物土壤定殖，與病原菌競爭營養及生存空間、分泌抑菌物質及蛋白酶、激發植物體的抗性免疫機制、促進植物生長、強化抗逆性等綜合作用形成對土傳病害的預防與防治效果。

蠶沙是養蠶生產中的主要有機廢棄物，不但含有豐富的營養物質，還含有豐富的微生物菌群，例如固氮、解磷和解鉀及其病原拮抗的微生物菌群。因此如何分離篩選并有效利用其中的微生物資源，成為本研究的關注重點。

技術實現要素：

基于以上現有技術，本發明的首要目的在于提供一株來源于蠶沙的菌株bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)sem-9。

本發明的另一目的在于提供上述bacillussubtilissem-9在制備拮抗鐮刀菌微生物菌劑或蠶沙微生物菌肥中的應用。

本發明目的通過以下技術方案實現：

一株來源于蠶沙的菌株bacillussubtilissem-9，已于2017年5月10日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏編號為gdmccno.60169。

上述枯草芽孢桿菌sem-9是從蠶沙中分離純化后得到，其性狀如下：

菌落形態：本發明的枯草芽孢桿菌sem-9菌懸液經涂板與na培養基后，37℃生化培養箱中培養3天，觀察其菌落形態特征，結果如圖1所示。由圖1可見，本發明的枯草芽孢桿菌sem-9菌落乳白色，圓形，表面皺褶，不透明，邊緣不整齊。

將本發明的枯草芽孢桿菌sem-9按1％比例接種于nb培養基，37℃搖床中培養14h后，取懸液，點樣到載玻片、烤片，經革蘭氏染色，油鏡觀察菌株的形態特征，結果如圖2所示。由圖2可見，本發明的枯草芽孢桿菌sem-9為革蘭氏陽性菌，芽孢中生，為橢圓形，菌體為桿狀。

上述bacillussubtilissem-9在制備拮抗鐮刀菌微生物菌劑中的應用。

優選地，所述拮抗鐮刀菌微生物菌劑是指微生物菌液或微生物原粉。

優選地，所述微生物菌液通過如下方法制備得到：

將枯草芽孢桿菌sem-9菌種活化，發酵，得到活芽孢含量為50～60×10⁸cfu/ml的枯草芽孢桿菌sem-9菌液。通過灌根或者葉面噴灑的方法，可以有效防治作物枯萎病。

優選地，所述微生物原粉通過如下方法制備得到：

將枯草芽孢桿菌sem-9菌種活化，發酵，得到活芽孢含量為50～60×10⁸cfu/ml的成熟發酵菌液，經碟片離心機或微濾設備濃縮后，加入輕質碳酸鈣攪拌混合均勻，得到液固混合物，噴霧干燥，得到枯草芽孢桿菌sem-9原粉。

優選地，所述枯草芽孢桿菌sem-9原粉的活菌濃度為5～6億/克干粉。

優選地，所述輕質碳酸鈣的加入量為濃縮后的成熟發酵菌液質量的3％。

上述bacillussubtilissem-9在制備蠶沙微生物菌肥中的應用，所述應用過程為：將枯草芽孢桿菌sem-9原粉與蠶沙或堆肥腐熟后的蠶沙、煙梗和貝殼粉混勻，得到蠶沙微生物菌肥。

優選地，所述蠶沙微生物菌肥中各組分的質量百分含量為：枯草芽孢桿菌sem-9原粉1％～10％，蠶沙或堆肥腐熟后的蠶沙60％～80％，煙梗10％～20％，貝殼粉10％～30％，所有組分之和為100％。

本發明的菌株具有如下優點及有益效果：

(1)本發明的bacillussubtilissem-9菌株來源于蠶沙，為蠶沙堆肥過程中的自生菌，與蠶沙有機肥的配合性好；

(2)本發明的bacillussubtilissem-9菌株可以高效抑制枯萎病、根腐病等作物土傳病害的發生，起到防治作物病害和提高作物抗病蟲害能力的作用，從而提高作物的產量和品質；

(3)本發明的bacillussubtilissem-9菌株耐高溫性好，在60度高溫下培養和運輸均可以存活，在土壤微生物菌劑制備方面具有相當的優勢；

(4)本發明的bacillussubtilissem-9菌株耐鹽堿性好，可以在7％的nacl濃度及ph5～9的范圍內生長良好，在鹽堿地改良方面具有相當的優勢。

附圖說明

圖1為本發明bacillussubtilissem-9的菌落形態特征圖；

圖2為本發明bacillussubtilissem-9的菌株形態特征圖；

圖3為本發明bacillussubtilissem-9在不同溫度下的生長曲線圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

bacillussubtilissem-9菌株的分離及鑒定

(1)樣品稀釋：從發酵腐熟的蠶沙堆肥中取樣，稱取5g溶解到裝有45ml無菌水的三角瓶中，150rpm振蕩器振蕩成均勻的10^-1稀釋液，然后用1ml移液槍吸取該稀釋液1ml至裝有9ml無菌水的試管中，充分搖勻，即制成10^-2的樣品稀釋液，并依次稀釋至10^-6。

(2)培養基準備：

解無機磷篩選培養基：葡萄糖10.0g、ca3(po4)25.0g、(nh4)2so40.5g、nacl0.2g、kcl0.2g、mgso4·7h2o0.1g、feso4·7h2o0.03g、mnso4·4h2o0.03g、酵母粉0.5g、蒸餾水1000ml、ph6.8～7.2，滅菌20min；

馬鈴薯土豆培養基：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水1000毫升、ph6.8～7.2；

na培養基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，ph7.0；121℃滅菌20min，于45℃-55℃傾倒至無菌的培養皿。

(3)菌種分離、純化與篩選：分別吸取不同稀釋倍數的稀釋液0.1ml，均勻涂布于冷卻好的解無機磷培養基，放置30℃培養箱中倒置培養5天，觀察并挑選長勢良好、解磷圈顯著的菌落于na培養基培養；將所挑選出菌于na培養基多次繼代培養后，通過平板對峙法，檢測與鐮刀菌的拮抗效果，取拮抗效果顯著的一個菌株，即為bacillussubtilissem-9菌株。

(4)菌株的鑒定

a、形態鑒定：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9菌株的菌落形態為乳白色，圓形，表面皺褶，不透明，邊緣不整齊。革蘭氏染色結果表明bacillussubtilissem-9為革蘭氏陽性菌，芽飽橢圓形、中生，菌體為桿狀。

b、基因組測序比對分析：sem-9的全基因組序列經illuminahiseq4000平臺測序分析發現，sem-9的基因組含有4,218個基因，總長度為3,638,439bp，平均長度863bp，占基因組全長的88.27％。串聯重復序列共53個，總長為3,754bp，占基因組全長的0.0911％。小衛星序列40個，微衛星序列2個。trna86個，rrna30個。其16srrna基因片段長度為1401bp，與多株bacillussubtilisstrain相似性達99％以上，具體序列見序列表。

(5)菌株sem-9鑒定結論

根據菌株sem-9的形態學及基因組數據比對分析，鑒定sem-9為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，已于2017年5月10日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏編號為gdmccno.60169。保藏地址：中國廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，郵政編碼為510075。

(6)菌株拮抗鐮刀菌效果測定：

采用平板對峙法，在平板中央分別接種枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌，fusariumoxysporum，在距其約1.5cm處放置濾紙片(去除表面活性劑，肥皂水浸泡，沖洗干凈，烘干，滅菌)，點5ul枯草芽孢桿菌sem-9的發酵液，待完全吸收后，倒置培養2-3天，觀察，其對鐮刀菌菌落半徑抑制率。結果表明：枯草芽孢桿菌sem-9對所測尖胞鐮刀菌有非常顯著的拮抗效果，菌落半徑抑制率達74％左右。

鐮刀菌孢子發芽率抑制實驗：制備1～3×10⁷cfu/ml濃度的尖胞鐮刀菌孢子懸液。將本發明的菌株發酵液冷凍干燥，凍干粉與pdb培養基配制0.1g/ml濃度的發酵液，該發酵液分別與pda培養基按比例配制12.5％，25％和50％體積濃度的培養液。接種孢子終濃度為10⁶cfu/ml，并分別在6h、12h和24h統計鐮刀菌孢子的發芽率。結果如表1所示。

表1sem-9發酵液對尖胞鐮刀菌孢子發芽率的影響

由表1可知，隨著發酵液濃度升高，對鐮刀菌孢子的發芽抑制效果也增強，與對照相比，孢子發芽抑制率可達70％～80％。

(7)菌株耐高溫及鹽堿度測定：

耐高溫測試：將本發明菌株活化后，1％的比例接種到離心管里，分別在37℃，50℃和60℃，轉速200rpm的條件下培養，檢測其在od600nm的生長曲線，結果如圖3所示。結果表明：在50℃和60℃高溫下，本發明的菌株都能正常生長，只是生長有2～4h的延滯。

耐鹽堿度測試：將本發明菌株活化后，按1％的比例分別接種到ph范圍在3～10的培養基里，及含nacl濃度1～10％的培養基中，37℃，200rpm培養過夜，看菌株生長情況。結果發現本發明sem-9菌株在ph5～9的范圍內及nacl濃度7％以內正常生長。

實施例2

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9菌液、菌劑原粉及蠶沙微生物菌肥的制備：

(1)活化菌種

活化枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9菌株，從斜面中挑取菌落并在na固體培養基劃線培養，培養條件37℃，待sem-9在na固體培養基上生長18-24h后，挑取單菌落，用于一級種子液的制備；

(2)一級種子液的制備

選取na固體培養基上的單菌落，接種于一級種子搖瓶中，搖瓶體積為250ml，一級種子nb液態培養基(121℃下，滅菌20min)的裝液量100ml，將一級種子搖瓶在37℃、200r/min下培養14h，得到一級種子液；

(3)二級種子液的制備

種子罐中的培養基仍為nb液體培養基，121℃下，滅菌20min，將一級種子液接入種子罐中，接種量為0.7～1％(v/v)；培養條件為：通氣比1:1，攪拌轉速為250～400r/min，培養溫度32℃，罐壓0.05mpa，培養時間為12小時，培養結束時得到二級種子液，其活菌含量為1～3×10⁷cfu/ml，od值在0.8～0.9左右，此時菌種活力強；

(4)枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9的菌液發酵

發酵培養基配方(重量百分比)：玉米淀粉2-3％g；豆粕粉1.5-2.5％；酵母膏0.5～1％，caco30.3-0.6％，k2hpo40.02-0.03％，mgso4·7h2o0.015-0.025％，mnso4·h2o0.015-0.025％，(nh4)2so40.05-0.15％；ph6.5-7.5，121℃滅菌20min；

將枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9的二級種子液，按照接種量為0.5～1％(v/v)接入發酵罐中，培養條件為：接種量為0.5-1％(v/v)，培養條件為：通氣比1:(1-1.5)，攪拌轉速為200-400r/min，培養溫度32℃，罐壓0.05mpa，保持5％以上的溶氧條件，培養時間為48h左右；下罐時間以取樣鏡檢芽孢90％以上釋放為準，成熟發酵液中枯草芽孢桿菌sem-9活芽孢含量為10～50×10⁸cfu/ml，得到發酵成熟菌劑；

(5)枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9原粉的制備

步驟(4)所得的發酵成熟菌劑(活芽孢含量為50～60×10⁸cfu/ml)經碟片離心機或微濾設備濃縮后，加入輕質碳酸鈣，濃縮成熟發酵菌劑與輕質碳酸鈣的重量比為100:3，得到液固混合物，將該液固混合物攪拌30min后，利用輸料泵將液固混合物送入離心式噴霧塔中干燥，得到枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9原粉。

所得枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9原粉中活菌濃度為5～6億/克干粉。

(6)枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9蠶沙微生物菌肥的制備

將步驟(5)所得枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sem-9原粉按比例與蠶沙或堆肥腐熟后的蠶沙、煙梗和貝殼粉混勻，獲得蠶沙微生物菌肥。所述蠶沙或堆肥腐熟化處理后的蠶沙、sem-9原粉、煙梗和貝殼粉的質量百分含量分別為60％～80％、1％～10％，10％～20％和10％～30％。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>廣東植物龍生物技術股份有限公司

<120>一株來源于蠶沙的菌株bacillussubtilissem-9及其應用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1401

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gdmccno.6016916srrna基因片段序列

<400>1

aggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtaca60

aggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttc120

acgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaac180

ctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataa240

ggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcacctt300

agagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaa360

cccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccga420

aggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcg480

ttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgag540

tttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaa600

ggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatc660

taatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgc720

cttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccac780

tctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccggggg840

ctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaa900

cgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggtt960

aggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacagagct1020

ttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattg1080

cggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtg1140

gccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaa1200

ctagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtttga1260

accatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtct1320

tacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctc1380

ccatctgtccgctcgacttgc1401