促進3β?HSD基因表達的表達載體及其構建方法和應用與流程

本發明涉及生物
技術領域：
，特別是涉及一種促進3β-hsd基因表達的表達載體及其構建方法和應用。
背景技術：
：固醇激素在大多數脊椎動物細胞的分化、發育、生長和生理功能的發揮中起重要的作用。類固醇激素的生成有賴于原料膽固醇的提供及一系列的類固醇生成酶的催化。其中，3β-超類固醇脫氨酶(3β-hsd)在糖皮質激素、鹽皮質激素和性激素的生物合成中起重要的作用。傳統的3β-hsd基因表達技術中，例如柳海燕等利用促性腺激素釋放激素激動劑通過erkmapk途徑實現了大鼠睪丸間質細胞3β-hsd基因表達的調控；祝輝等則研究了hcg對成年小鼠睪丸leydig細胞中3β-hsd表達的調節。上述研究均為應用間接手段調控3β-hsd基因表達，目前缺乏能夠轉染到人源細胞，并在人源細胞中持續、穩定且高效表達3β-hsd基因的表達載體。技術實現要素：基于此，有必要提供一種能夠在人源細胞中持續、穩定且高效表達3β-hsd基因的表達載體及其構建方法和應用。一種促進3β-hsd基因表達的表達載體，包括慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段，所述多克隆位點包括ecori酶切位點和noti酶切位點，所述目的基因表達片段中含有用于表達3β-hsd的3β-hsd基因編碼序列，所述目的基因表達片段的5’端具有ecori酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段的3’端具有noti酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段正向插入在所述多克隆位點序列的所述ecori酶切位點和所述noti酶切位點之間。在一個實施方式中，所述3β-hsd基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。在一個實施方式中，所述ecori酶切位點黏性末端的3’端直接與所述3β-hsd基因編碼序列的5’端連接，所述noti酶切位點黏性末端的5’端直接與所述3β-hsd基因編碼序列的3’端連接，所述ecori酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-aattc-3’，所述noti酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-ggccgc-3’。一實施方式的促進3β-hsd基因表達的表達載體的構建方法，包括以下步驟：以3β-hsd基因編碼序列作為擴增模板，并加入上游引物和下游引物后進行pcr擴增，得到pcr擴增產物，所述上游引物包括針對所述3β-hsd基因編碼序列的5’端設計的序列和針對ecori酶切位點設計的序列，所述下游引物包括針對所述3β-hsd基因編碼序列的3’端設計的序列和針對noti酶切位點設計的序列；對所述pcr擴增產物進行加a尾反應，使得所述pcr擴增產物的兩端連接a堿基，并將加a尾反應后的所述pcr擴增產物連接到t載體中，得到重組t載體；用限制性內切酶ecori和限制性內切酶noti對所述重組t載體進行雙酶切，得到目的基因表達片段；以及將所述目的基因表達片段連接到經過限制性內切酶ecori和限制性內切酶noti雙酶切處理后的慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，得到所述促進3β-hsd基因表達的表達載體。在一個實施方式中，所述3β-hsd基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述上游引物的堿基序列如seqidno.2所示，所述下游引物的堿基序列如seqidno.3所示。一種含有3β-hsd基因的慢病毒，通過如下方法制備得到：將上述的促進3β-hsd基因表達的表達載體轉染進入293ft細胞中；以及對轉染后的所述293ft細胞擴增表達，獲得所述含有3β-hsd基因的慢病毒。一種組合物在制備抗腫瘤的藥物中的應用，所述組合物包括上述促進3β-hsd基因表達的表達載體。在一個實施方式的應用中，所述組合物還包括塑化劑。在一個實施方式的應用中，所述塑化劑為鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯。在一個實施方式的應用中，所述組合物用于制備抗乳腺癌的藥物。上述促進3β-hsd基因表達的表達載體包括慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段。多克隆位點序列包括ecori酶切位點和noti酶切位點，目的基因表達片段中含有用于表達3β-hsd的3β-hsd基因編碼序列，目的基因表達片段的5’端具有ecori酶切位點黏性末端，3’端連具有noti酶切位點黏性末端。目的基因表達片段正向插入在多克隆位點序列的ecori酶切位點和noti酶切位點之間。發明人在載體的選擇、目的基因插入位點、構建方法等方面進行了大量的探索研究，預料不到地發現，將含有3β-hsd基因編碼序列的目的基因表達片段正向插入在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，成功地構建出能夠特異性促進3β-hsd基因表達的表達載體。實驗結果表明該表達載體能夠轉染到人源細胞中，并在人源細胞中持續、穩定且高效表達3β-hsd基因。轉染了該促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞系mcf-7細胞表達的3β-hsd是對照組的104.5倍，表達量具有顯著的差異。該表達載體還能增加塑化劑對腫瘤細胞的毒性，實驗結果表明，轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用，有望應用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。附圖說明圖1為一實施方式的促進3β-hsd基因表達的表達載體的構建方法的流程圖；圖2為實施例1中3β-hsd基因編碼序列pcr擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3為實施例1中所用的plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro骨架載體的譜圖；圖4為實施例4中熒光定量pcr檢測mcf-7細胞和轉染促進3β-hsd基因表達的表達載體的mcf-7細胞的3β-hsd的mrna表達水平結果圖；圖5為實施例5中westernblot檢測兩組細胞3β-hsd蛋白表達水平的結果圖；圖6為對圖5中的圖像用imagej軟件進行條帶灰度定量分析3β-hsd蛋白表達水平結果圖；圖7為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax的mrna表達水平結果圖；圖8為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-3的mrna表達水平結果圖；圖9為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-8的mrna表達水平結果圖；圖10為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erα的mrna表達水平結果圖；圖11為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erβ的mrna表達水平結果圖；圖12為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的dna損傷基因hogg1的mrna表達水平結果圖；圖13為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的dna損傷基因mth1的mrna表達水平結果圖。具體實施方式為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施例及附圖對本發明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。一實施方式的促進3β-hsd基因表達的表達載體，包括慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段。多克隆位點包括ecori酶切位點和noti酶切位點。目的基因表達片段中含有用于表達3β-hsd的3β-hsd基因編碼序列，目的基因表達片段的5’端具有ecori酶切位點黏性末端，目的基因表達片段的3’端具有noti酶切位點黏性末端。目的基因表達片段正向插入在多克隆位點序列的ecori酶切位點和noti酶切位點之間。具體地，抗性基因序列用于篩選轉化后的表達載體。在一個實施方式中，抗性基因序列選自氨芐青霉素抗性基因序列和卡那霉素抗性基因序列中的至少一種。具體地，多克隆位點序列中包括多個酶切位點，除ecori酶切位點和noti酶切位點之外，多克隆位點序列中還可以包括hpai酶切位點、sfii酶切位點和sbfi酶切位點等。具體地，啟動子(promoters)序列用于控制表達載體中的基因表達的起始時間和表達的程度。在一個實施方式中，ecori酶切位點黏性末端的3’端直接與3β-hsd基因編碼序列的5’端連接，noti酶切位點黏性末端的5’端直接與3β-hsd基因編碼序列的3’端連接。進一步地，ecori酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-aattc-3’，noti酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-ggccgc-3’。具體地，目的基因表達片段中含有用于表達3β-hsd的3β-hsd基因編碼序列，3β-hsd基因編碼序列從ncbi數據庫中篩選獲得。在一個實施方式中，3β-hsd基因編碼序列依據3β-hsd的mrna序列設計。具體為篩選出ncbi數據庫的genbanknm_001328615，設計得到3β-hsd基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，3β-hsd基因編碼序列以雙鏈的形式存在，3β-hsd基因編碼序列的5’端連接有ecori酶切位點黏性末端，ecori酶切位點黏性末端包括經ecori酶酶切后的一段堿基序列，例如aattc。3β-hsd基因編碼序列的3’端連接有noti酶切位點黏性末端，noti酶切位點黏性末端包括經noti酶酶切后的一段堿基序列，例如tcgag，設置ecori酶切位點黏性末端以及ecori酶切位點黏性末端使得3β-hsd基因編碼序列能夠順利的插入到慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中。進一步地，ecori酶切位點黏性末端以及noti酶切位點黏性末端中還含有保護序列，提高酶切效率。發明人在載體的選擇、目的基因插入位點、構建方法等方面進行了大量的探索研究，預料不到地發現，將含有3β-hsd基因編碼序列的目的基因表達片段正向插入在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，成功地構建出能夠特異性促進3β-hsd基因表達的表達載體。實驗結果表明該表達載體能夠轉染到人源細胞中，上述表達載體具有轉染效率高，用量少，并在人源細胞中持續、穩定且高效表達3β-hsd基因的優點，轉染了該促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞系mcf-7細胞表達的3β-hsd是對照組的104.5倍，表達量具有顯著的差異，可作為有力工具應用于制備治療3β-hsd基因表達異常相關疾病藥物的研究和開發中。進一步地，該表達載體還能增加塑化劑對腫瘤細胞的毒性。實驗結果表明，轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的細胞凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因的表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用，該表達載體有望應用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。請參閱圖1，一實施方式的上述促進3β-hsd基因表達的表達載體的構建方法，包括以下步驟s110～s140。s110、以3β-hsd基因編碼序列作為擴增模板，并加入上游引物和下游引物后進行pcr擴增，得到pcr擴增產物，上游引物包括針對3β-hsd基因編碼序列的5’端設計的序列和針對ecori酶切位點設計的序列，下游引物包括針對3β-hsd基因編碼序列的3’端設計的序列和針對noti酶切位點設計的序列。具體地，目的基因表達片段中含有用于表達3β-hsd的3β-hsd基因編碼序列，3β-hsd基因編碼序列從ncbi數據庫中篩選獲得。在一個實施方式中，3β-hsd基因編碼序列依據3β-hsd的mrna序列設計。具體為篩選出ncbi數據庫的genbanknm_001328615，設計得到3β-hsd基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。設計的3β-hsd基因編碼序列可通過基因合成的方式獲得。上游引物包括針對3β-hsd基因編碼序列的5’端設計的序列和針對ecori酶切位點設計的序列，下游引物包括針對3β-hsd基因編碼序列的3’端設計的序列和針對noti酶切位點設計的序列，通過上游引物和下游引物的擴增，使得3β-hsd基因編碼序列具有ecori酶切位點和noti酶切位點。具體地，上游引物中包括擴增ecori酶切位點的序列以及保護序列，下游引物中包括擴增noti酶切位點的序列以及保護序列，使得pcr擴增得到的pcr擴增產物具有ecori酶切位點和noti酶切位點。上下游引物無引物二聚體且退火溫度差距較小。在一個實施方式中，上游引物的堿基序列如seqidno.2所示，下游引物的堿基序列如seqidno.3所示。具體地，按照premixprime3β-hsdhs的使用說明配置反應體系進行pcr，退火溫度為62℃。pcr擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用dna膠回收試劑盒回收約1000bp左右的pcr產物，得到pcr擴增產物。s120、對s110中得到的pcr擴增產物進行加a尾反應，使得pcr擴增產物的兩端連接a堿基，并將加a尾反應后的pcr擴增產物連接到t載體中，得到重組t載體。具體地，用extaq酶對pcr擴增產物進行加a尾反應，參見extaq酶的使用說明書，在extaq酶的條件下，將pcr擴增產物的兩端分別加上a堿基，形成加a尾的pcr擴增產物，使得pcr擴增產物能夠順利連接到t載體中。具體地，參見t4dna連接酶的使用說明書，將兩端加a堿基后的pcr擴增產物連接到t載體中，形成重組t載體。具體地，獲得重組t載體后，還包括對重組t載體的擴增和鑒定。具體包括將重組t載體轉化進入大腸桿菌感受態細菌中，篩選獲得陽性單克隆，培養陽性單克隆并提取獲得大量的重組t載體。大腸桿菌感受態細菌例如為jm107感受態細菌或dh5α感受態細菌等。本實施方式中，將重組t載體轉化進入jm107感受態細菌中，涂布在具有抗性的培養基上，挑取陽性單克隆小量培養并測序鑒定。然后將測序正確的菌液擴大培養，提取細菌中的重組t載體。s130、用限制性內切酶ecori和限制性內切酶noti對s120中得到的重組t載體進行雙酶切，得到目的基因表達片段。具體地，挑取測序正確的重組t載體，先進行noti酶切，用核酸共沉劑回收酶切產物后，再用ecori酶切，電泳鑒定后，用dna膠回收試劑盒回收的酶切產物，得到目的基因表達片段。該目的基因片段的5’端有ecori酶切位點黏性末端，該目的基因片段的3’端有noti酶切位點黏性末端。s140、將s130中得到的目的基因表達片段連接到經過限制性內切酶ecori和限制性內切酶noti雙酶切處理后的慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，得到促進3β-hsd基因表達的表達載體。慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro先經過限制性內切酶ecori和限制性內切酶noti雙酶切處理，打開缺口，使得目的基因表達片段順利插入到慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，獲得促進3β-hsd基因表達的表達載體。一實施方式的含有3β-hsd基因的慢病毒，通過如下方法制備得到：該上述促進3β-hsd基因表達的表達載體轉染進入293ft細胞中，通過對轉染后的293ft細胞擴增表達，從而獲得含有3β-hsd基因的慢病毒。具體地，將轉染后的293ft細胞培養36h～60h后，收集細胞上清培養基用濾膜過濾，得到含有3β-hsd基因的慢病毒的上清液。獲得含有3β-hsd基因的慢病毒后，還包括使用lenti-xgostix金標試劑盒測定病毒滴度，然后保存于-80℃條件下。上述促進3β-hsd基因表達的表達載體的構建方法操作簡單，在載體的選擇、目的基因插入位點、構建方法等方面進行了大量的探索研究，將含有3β-hsd基因編碼序列的目的基因表達片段正向插入在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，成功地構建出能夠特異性促進3β-hsd基因表達的表達載體。實驗結果表明該方法構建的表達載體能夠轉染到人源細胞中，具有轉染效率高，用量少，并在人源細胞中持續、穩定且高效表達3β-hsd基因的優點。轉染了該促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞系mcf-7細胞表達的3β-hsd是對照組的104.5倍，表達量具有顯著的差異。本文還提供一實施方式的組合物在制備抗腫瘤的藥物中的應用，該組合物包括上述的促進3β-hsd基因表達的表達載體。具體地，該組合物可以是應用于預防腫瘤的疫苗，也可以是應用于治療已經確診為腫瘤甚至癌癥的藥物。進一步地，該組合物為用于制備抗乳腺癌的藥物。在一個實施方式中，該組合物還包括塑化劑。具體地，塑化劑為鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(dehp)。進一步地，塑化劑在組合物中的濃度為0.05mmol/l以上，優選0.80mmol/l以上。可以理解，該組合物中還可以包括淀粉、硬質酸鈉等藥物輔助劑。在一個實施方式的應用中，該組合物應用在促進凋亡基因bax、caspase-3或caspase-8表達的抗腫瘤藥物中。優選地，該組合物應用在促進凋亡基因bax的抗腫瘤藥物中。在一個實施方式的應用中，該組合物應用在促進雌激素受體基因erα或erβ表達的抗腫瘤藥物中。優選地，該組合物應用在促進雌激素受體基因erα表達的抗腫瘤藥物中。在一個實施方式應用中，該組合物應用在促進dna氧化損傷基因hogg1或mth1表達的抗腫瘤藥物中。進一步地，該組合物應用在同時促進凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達的抗腫瘤藥物中。進一步地，塑化劑與促進3β-hsd基因表達的表達載體形成的組合物應用在同時促進凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達的抗腫瘤藥物中。實驗結果表明，將上述促進3β-hsd基因表達的表達載體轉染到乳腺癌細胞系mcf-7細胞中后，mcf-7表達的3β-hsd是對照組的104.5倍，表達量具有顯著的差異。轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用。有望應用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。此外，即使在塑化劑的濃度為0mmol/l，即塑化劑不存在的條件下。轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax、caspase-3或caspase-8，雌激素受體基因erα、erβ和dna氧化損傷基因hogg1的表達量也高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，說明該促進3β-hsd基因表達的表達載體本身對腫瘤細胞具有毒性，對腫瘤細胞的損害作用，有望應用在抗腫瘤的藥物中。下面為具體實施例部分。以下實施例中，如無特別說明，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如參見薩姆布魯克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟楓等譯)所著的的分子克隆實驗指南[m](北京：科學出版社，1992)中所述的條件或者試劑盒生產廠家推薦的方法實現。實施例中所使用的試劑均為市售。實施例中所用的材料：限制性內切酶ecori、noti(美國fermentas公司)，t4dna連接酶(美國fermentas公司)，dna膠回收試劑盒rneasyminikit試劑盒(德國qiagen公司)，primescriprtreagentkit和sybrprimescriptrt-pcrkit(中國takara公司)，質粒小量提取和無內毒素質粒小量提取試劑盒(美國omegabio-tek公司)，j107大腸桿菌感受態(天根生物公司)，真核表達載體plvx-mcuv-zsgreen-pglc-puro(以下簡稱plvx載體，biovector公司)，包裝輔助質粒plvx-gfp和該質粒對應的慢病毒包裝試劑盒(美國clontech公司)，用于慢病毒包裝的293ft細胞(美國invitrogen公司)，rpmi-1640培養基和10％胎牛血清(美國gibco公司)，人乳腺癌mcf-7細胞(中國上海細胞庫)，dmso(美國sigma公司)，dehp(純度>99％，tci公司)，bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1基因pcr引物由上海生工合成，鼠抗gapdh一抗、兔抗3β-hsd(ab133657)一抗、羊抗鼠igg-hrp和羊抗兔igg-hrp均為美國thermoscientific公司產品。實施例1構建促進3β-hsd基因表達的表達載體(1)3β-hsd目的基因表達片段引物的設計。根據ncbi數據庫genbanknm_001328615設計3β-hsd基因編碼序列，獲得核苷酸序列如seqidno.1所示的3β-hsd基因編碼序列(3β-hsd的cdna序列)。使用oligo7對其進行分析，搜索上下游引物(要求盡可能無引物二聚體且退火溫度差距較小)，然后在上游引物的5’端加入保護堿基與ecori酶切位點序列，下游引物的5’端分加入保護堿基與noti酶切位點序列，設計得到的引物序列如表1所示。設計的pcr引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。表1：3β-hsd基因編碼序列的pcr擴增引物上游引物5’-ggaattccatgacgggctggagctg-3’(seqidno.2)下游引物5’-cgcggccgcctgagtcttggacttcag-3’(seqidno.3)(2)3β-hsd基因編碼序列(cdna)的擴增及其重組t載體的構建按照premixprime3β-hsdhs的使用說明配置反應體系進行pcr，退火溫度為62℃。pcr完成后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖2所示。然后用dna膠回收試劑盒回收約1000bp的pcr產物，得到pcr擴增產物。并再用extaq酶進行加a尾反應。按照t4dna連接酶的說明書，將加a尾產物與t載體連接，轉化jm107感受態細菌。常規篩選鑒定，挑取小量培養的pcr鑒定陽性克隆的細菌菌液進行測序鑒定。將測序正確的菌液擴大培養，提取細菌中的重組t載體。(3)促進3β-hsd基因表達的表達載體與鑒定挑取測序正確的重組t載體，先進行noti酶切，用核酸共沉劑回收酶切產物后，再用ecori酶切。電泳鑒定后，用dna膠回收試劑盒回收的酶切產物，，得到目的基因表達片段。然后將目的基因表達片段與經過相同處理的plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro慢病毒載體連接。plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro骨架載體的譜圖請參閱圖3。進一步將連接后的載體轉化jm107感受態細菌，小量培養篩選出來的細菌取重組質粒進行pcr鑒定，并將菌液進行測序鑒定。將測序結果證實3β-hsd基因cdna序列正確插入的菌液擴增培養，用去內毒素質粒提取試劑盒對重組質粒進行抽提，得到特異性促進3β-hsd基因表達的表達載體(plvx-3β-hsd)。實施例2制備含有3β-hsd基因的慢病毒培養293ft細胞，取生長狀態良好的細胞接種到六孔中，每孔106個細胞，用慢病毒包裝輔助試劑盒，取實施例1中抽提的plvx-3β-hsd重組載體2μg轉染到293ft細胞，置于37℃培養48h后將上清培養基用0.45μm濾膜過濾，收集病毒上清，使用lenti-xgostix金標試劑盒測定病毒滴度，然后保存于-80℃。實施例3慢病毒轉導人乳腺癌mcf-7細胞取實施例2獲得的病毒上清，用rpmi-1640完全培養基按1:1稀釋后，再加入polybrene至終濃度為6μg/ml～10μg/ml待用。將3×105個mcf-7細胞接種于t25細胞培養瓶中，培養18h后細胞匯合度達到50％，去除培養瓶中原有的完全培養基，用pbs洗兩遍后加入上述含慢病毒的rpmi-1640完全培養基。轉染24h，去除含慢病毒的rpmi-1640完全培養基，加入正常的rpmi-1640完全培養基再培養24h，然后換用1μg/ml嘌呤霉素對細胞進行篩選，每隔2天換液1次，篩選時間為7天，篩選獲得3β-hsd基因高表達的mcf-7細胞株(plvx-3β-hsd細胞株)。實施例4熒光定量pcr檢測3β-hsd基因表達量根據gapdh(genbanknm_002046.5)和3β-hsd(genbanknm_001328615)基因mrna序列，利用引物設計軟件oligo7.0設計pcr引物，引物序列如表2所示。表2：gapdh和3β-hsd基因的pcr引物分別接種mcf-7細胞、實施例3制備的3β-hsd基因高表達的mcf-7細胞株(plvx-3β-hsd細胞株)至6孔板。細胞密度達到80％-90％時，用rneasyminikit提取各組細胞的總rna，利用primescriprtreagentkit將mrna逆轉錄為cdna，逆轉錄條件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反轉錄結束后，加入90μl的rnasefreedh2o稀釋cdna，-20℃保存，以便后面檢測使用。取各組細胞的cdna1μl為模板，分別加入表2中的引物，以gapdh為內參，實時熒光定量pcr檢測3β-hsd相對表達量，設置反應條件：95℃30s，1循環；54℃30s，40循環；95℃5s；60℃1min，95℃15s，利用sybrprimescriptrt-pcrkit檢測各組細胞3β-hsd基因相對表達量，結果如圖4所示。可以看到，plvx-3β-hsd細胞株的3β-hsd基因表達水平較正常的mcf-7細胞提高了104.5倍，具有非常顯著的差異(p<0.01)，說明本發明提供的3β-hsd基因cdna序列成功插入至plvx-mcuv-zsgreen-pglc-puro慢病毒載體中，能特異、持續、高效、穩定地促進3β-hsd基因高表達。實施例5westernblot檢測3β-hsd蛋白表達水平將正常mcf-7細胞、實施例3制備的plvx-3β-hsd細胞株分別接種到t25細胞培養瓶(1×106個)。培養約24h后待細胞匯合度達90％后去除培養基，吸棄細胞培養液，用冷pbs洗3次，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，100℃變性8min；用二辛可寧酸法(bicinchoninicacidassay，bca法)進行蛋白定量。總蛋自進行10％sds-pace電泳分離，接著將蛋白電轉至pvdf膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉2h。根據marker和分子量將膜上含gapdh(37kd),3β-hsd蛋白(42kd)的部分分別切下，加入相應的一抗，冰上孵育過夜；tbst緩沖液洗膜3次，每次10min。加入對應的二抗，室溫孵育1h；tbst緩沖液洗膜3次，每次10min。加入westernblot化學發光試劑光后用冷ccd成像系統對其進行曝光拍照，結果如圖5所示。所得圖像用imagej軟件進行條帶灰度定量分析結果如圖6所示。可以看到，plvx-3β-hsd細胞株的3β-hsd蛋白質表達水平比對照組升高1.83倍，差異具有非常顯著統計學意義(p<0.01)。這說明plvx-3β-hsd細胞株構建成功，能持續、高效、穩定地高表達3β-hsd蛋白。實施例6促進3β-hsd基因表達的表達載體對凋亡基因、雌激素受體基因、dna氧化損傷基因的mrna的表達量的影響將mcf-7細胞、實施例3制備的plvx-3β-hsd細胞株(3β-hsd基因高表達的mcf-7細胞)分別分接種到6孔板中，待細胞融合度達80％時進行dehp染毒。dehp終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/l，以5‰dmso作為對照，對細胞染毒24h。染毒結束后，參見實施例4熒光定量pcr檢測3β-hsd基因表達量的方法分別測定的各組細胞中bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1基因表達水平的改變。具體為用rneasyminikit提取各組細胞的總rna，利用primescriprtreagentkit將mrna逆轉錄為cdna，逆轉錄條件：37℃，15min；85℃，5s；4℃下保存。反轉錄結束后，加入90μl的rnasefreedh2o稀釋cdna，-20℃保存，以便后面檢測使用。取各組細胞的cdna1μl為模板，分別加入表3中的引物，以gapdh為內參，實時熒光定量pcr檢測3β-hsd相對表達量，設置反應條件：95℃30s，1循環；54℃30s，40循環；95℃5s；60℃1min，95℃15s，利用sybrprimescriptrt-pcrkit檢測各組細胞bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1r基因相對表達量。bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1的pcr引物的序列如表3所示。表3：bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1的pcr引物實驗結果：(1)促進3β-hsd基因表達的表達載體對凋亡基因表達水平的影響在不同濃度的dehp條件下，兩組人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax、caspase-3、caspase-8的表達水平分別請參見圖7、圖8和圖9所示。圖中mcf-7-cells表示正常的mcf-7細胞對照組。3β-hsdoverexpressionmcf-7-cells表示轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的實驗組。不同條件下各基因的表達水平以dehp終濃度為0mmol/l的正常的mcf-7細胞的表達量為作為基準1計算。從圖7中可以看出，塑化劑dehp染毒24h后，轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到塑化劑dehp染毒24h，3β-hsd高表達細胞的凋亡基因bax表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高75％～126％，差異有統計學意義(p<0.01)。特別是當dehp終濃度為0.8mmol/l時，bax表達水平是正常的mcf-7細胞的2.2倍，表達量差異顯著。從圖8中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-3表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高23％～83％，差異有統計學意義(p<0.01)。從圖9中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-8表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高39％～125％，差異有統計學意義(p<0.01)。特別是當dehp終濃度為0.8mmol/l時，caspase-8表達水平是正常的mcf-7細胞的2.3倍，表達量差異顯著。(2)促進3β-hsd基因表達的表達載體對雌激素受體基因表達水平的影響在不同濃度的dehp條件下，兩組人乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erα、erβ的表達水平分別請參見圖10和圖11所示。從圖10中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的雌激素erα基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高25％～167％，差異有統計學意義(p<0.01)。從圖11中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的雌激素erβ基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高49％～245％，差異有統計學意義(p<0.01)。(3)促進3β-hsd基因表達的表達載體對dna損傷基因表達水平的影響在不同濃度的dehp條件下，兩組人乳腺癌細胞mcf-7的dna損傷基因hogg1、mth1的表達水平分別請參見圖12和圖13所示。從圖12中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的hogg1基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高52％～223％，差異有統計學意義(p<0.01)。從圖13中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進3β-hsd基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的mth1基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高20％～150％，差異有統計學意義(p<0.01)。以上結果表明，轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用。此外，即使在塑化劑的濃度為0mmol/l，即塑化劑不存在的條件下。轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax、caspase-3或caspase-8，雌激素受體基因erα、erβ和dna氧化損傷基因hogg1的表達量也高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7。說明該促進3β-hsd基因表達的表達載體本身對腫瘤細胞具有毒性，對腫瘤細胞的損害作用，有望應用在抗腫瘤的藥物中。以上所述實施例僅表達了本發明的一種或幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。sequencelisting<110>深圳市疾病預防控制中心<120>促進3β-hsd基因表達的表達載體及其構建方法和應用<160>21<170>patentinversion3.3<210>1<211>1119<212>dna<213>3β-hsd基因編碼序列<400>1atgacgggctggagctgccttgtgacaggagcaggagggtttctgggacagaggatcatc60cgcctcttggtgaaggagaaggagctgaaggagatcagggtcttggacaaggccttcgga120ccagaattgagagaggaattttctaaactccagaacaagaccaagctgacagtgctggaa180ggagacattctggatgagccattcctgaagagagcctgccaggacgtctcggtcatcatc240cacaccgcctgtatcattgatgtcttcggtgtcactcacagagagtctatcatgaatgtc300aatgtgaaaggtacccagctcctgttagaggcctgtgtccaagctagtgtgccagtcttc360atctacaccagtagcatagaggtagccgggcccaactcctacaaggaaatcatccagaat420ggccatgaagaagagcctctggaaaacacatggcccgctccatacccacacagcaaaaag480cttgctgagaaggctgtactggcggctaacgggtggaatctgaaaaacggcggcaccctg540tacacttgtgccttacgacccatgtatatctatggggaaggaagccgattcctttctgct600agtataaacgaggccctgaacaacaatgggatcctgtcaagtgttggaaagttctccact660gttaacccagtctatgttggcaatgtggcctgggcccacattctggccttgagggccctg720caggaccccaagaaggccccaa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