具有頭孢抗性且高表達Sir2蛋白的嗜酸乳桿菌及其應用的制作方法

本發明屬新菌種篩選和應用領域，更具體地說，本發明涉及一種具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17及其在相關食品或藥品中的應用。

背景技術：

乳酸桿菌是指一類以糖為原料，消耗葡萄糖產生乳酸的革蘭氏陽性菌，不形成芽孢，觸酶陰性，細胞色素缺失，營養需求苛刻，培養過程中除了要添加適量的水、碳源、氮源和無機鹽外，還需要加入維生素、氨基酸和肽等，耐酸，最適ph為5.5～6.0，最適溫度為30～40，兼性厭氧，dna中的g+c含量低于55％，在自然界分布廣泛，是動物和人腸道、陰道等處重要的益生菌群之一。乳酸桿菌是乳酸菌中最大的一個屬，目前，已經從哺乳動物的糞便、陰道分泌物、奶酪和酸菜等中分離到40余種乳酸桿菌，包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和羅伊乳桿菌等。乳酸桿菌作為益生菌，能在人體內表現出一定的益生功能，如阻止病原菌對腸道的入侵和定植，抑制病原菌生長，抗感染和維持腸道的微生態平衡等。乳酸桿菌不僅用于增強患者的免疫、營養、生長刺激等，同時也被廣泛應用于畜牧、食品加工等行業。可見，乳酸桿菌對人體的健康和生活都扮演著十分重要的角色。

乳酸桿菌作為一種普通安全等級(generallyregardedassafe，gras)的微生物，基本上沒有致病性，并具有其廣泛而至關重要的生理功能，特別是發揮著與宿主互利共生、維持宿主菌群平衡的益生作用。因此，乳酸桿菌作為益生菌所帶來的益生效益是不可小覷的，并且這些作用正不斷被發掘和深化。

sir2(silenceinformationregulator)基因是一類從細菌到高等真核生物都高度保守的nad+依賴的組蛋白/非組蛋白去乙酰化酶。sir2家族基因所編碼的sir2相關蛋白統一命名為sirtuin。sir2蛋白對細胞的存活、凋亡、衰老等生理活動的調節具有重要作用。目前尚未有高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌的相關報道。

技術實現要素：

本發明進一步對sir2蛋白和嗜酸乳桿菌進行研究，通過篩選具有頭孢抗性的嗜酸乳桿菌，再通過免疫印跡篩選出高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌，使其在疾病治療或相關食品、保健品中發揮作用。

為了實現上述發明目的，本發明篩選出一種具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmccno.60192，保藏地址為廣東省廣州市越秀區先烈中路100號大院59號樓5樓，保藏日期為2017年5月24日。

本發明具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17可用于制備抗衰老、增強免疫功能、抗菌或調節腸道菌群的食品或藥品。

為了實現上述發明目的，本發明還提供了一種抗衰老食品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌體蛋白成分。

為了實現上述發明目的，本發明還提供了一種抗衰老藥品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌體蛋白成分，以及藥學上可接受的載體。

為了實現上述發明目的，本發明還提供了一種增強免疫功能的食品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌體蛋白成分。

為了實現上述發明目的，本發明還提供了一種增強免疫功能的藥品，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌體蛋白成分，以及藥學上可接受的載體。

為了實現上述發明目的，本發明還提供了一種抗菌藥物，其包括有效劑量的作為活性成分的所述具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌體蛋白成分，以及藥學上可接受的載體。

為了實現上述發明目的，本發明還提供了一種調節腸道菌群的食品，其包括有效劑量的作為活性成分的權利要求1所述具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌體蛋白成分。該食品特別適用于因使用抗生素導致的腹瀉等腸道菌群紊亂的調節，使腸道菌群恢復平衡。

為了實現上述發明目的，本發明還提供了一種調節腸道菌群的藥品，其包括有效劑量的作為活性成分的權利要求1所述具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17和/或其菌體蛋白成分，以及藥學上可接受的載體。該藥品特別適用于因使用抗生素導致的腹瀉等腸道菌群紊亂的調節，使腸道菌群恢復平衡。

相對于現有技術，本發明經實驗發現，具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17具有一定的抑菌活性，還具有很強的頭孢抗性，可顯著提高器官中的mad含量，降低sod、gsh-px、no和nos的活性，因此本發明具有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilusla17可通過提高機體的抗氧化能力，清除衰老機體產生的過多自由基，抑制機體、組織、細胞的過氧化過程，最終起到延緩衰老和增強免疫的作用，可用于制備相關的食品或藥品，具有良好的應用價值。

附圖說明

圖1為本發明嗜酸乳桿菌sir2基因鑒定結果。

圖2為本發明嗜酸乳桿菌蛋白電泳圖。

圖3為本發明嗜酸乳桿菌sir2蛋白westernblot結果。

具體實施方式

以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。

實施例1

1.益生菌初篩

收集3個正常人糞便樣品各1.0g，用lb培養基擴增培養，蒸餾水稀釋至10^-8共9個稀釋度，取1ml，涂布到含有8～12g/l碳酸鈣的mrs分離固體培養基和改良mrs分離固體培養基上，置于厭氧培養箱中，37℃厭氧培養48h。培養結束后，取出平板挑選出具有可見溶鈣圈或藍色、淺藍色的菌落，并轉接至mrs增菌肉湯培養基中在37℃厭氧培養48h，并放入4℃冰箱保存備用。

2.菌株的形態學觀察。

將分離純化的菌株純培養物接種到增菌液體培養基中，37℃培養24h復活后，經革蘭氏染色操作后，在光學顯微鏡下觀察其細胞形態特征，并用帶有數字成像系統的顯微鏡選取合適視野進行照相記錄。

3.分子生物學-16srdna鑒定：

16srdna全長通用引物：引物1如seqidno：1所示；引物2如seqidno：2所示。

pcr反應體系(25μl)：引物1/1.0μl；引物2/1.0μl；10×pcrbuffer/2.5μl；dntpmix/2.0μl；taq酶/0.3μl；dna模板/1.0μl；超純水/25μl。

pcr反應條件為：先94℃-4min；再94℃-30s，55℃-40s，72℃-90s下循環30次，最后72℃-10min。

以無菌去離子水替代模板作為陰性對照。擴增結束后取3.0μl擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，切割待測膠帶送上海生工進行序列測定。將測定菌株的序列結果與ncbi中已知的16srdna序列進行blast對比分析得到最相近的菌株，以確定實驗所分離細菌的種屬。

4.抑菌活性測定

待測菌為上述獲得的菌，對照菌株為鼠李糖乳桿菌，分別取各菌100μl于100ml的乳酸菌mrs增菌肉湯培養基中進行活化復蘇。指示菌為escherichiacoliatcc11105、clostridiumdifficileny-5、staphylococcusaureusnt-12。

5.藥敏試驗

選擇10種抗菌藥物藥敏紙片：頭孢吡肟(fep，20μg)，頭孢噻肟(ctx，20μg)，利福平(rf，10μg)，氨芐西林(am，10μg)，四環素(te，20μg)，氯霉素(chl，20μg)，環丙沙星(cip，10μg)，阿米卡星(ak，20μg)，慶大霉素(gm，10μg)，甲氧芐氨嘧啶(tmp，10μg)，均購自廣州市宜康生物科技有限公司(oxoid)。

根據美國臨床實驗室標準化協會頒布的kb法進行藥敏試驗。首先用無菌鑷子分別夾取含有不同抗生素的藥敏紙片，分別貼在已接種待測菌的各平板(200μl待測菌菌懸液含菌數為3.0×10⁸cfu/ml，分別加入到溫度為50℃左右的乳酸菌mrs增菌肉湯瓊脂培養基)中，迅速混合均勻，倒平板。每個平板貼大約5張藥敏紙片，各紙片間距離大致相等，并做好標記。在37℃厭氧過夜培養，觀察平板抑菌情況，游標卡尺測定抑菌圈的大小并記錄

6.sir2基因的鑒定

以待測菌的基因組dna為模板，嗜酸乳桿菌sir2引物：上游引物如seqidno：3所示，下游引物如seqidno：4所示

pcr反應體系：模板-1μl；上游引物-0.5μl；下游引物-0.5μl；dntp(10mm)-0.5μl；lataq(5u/μl)-0.5μl；10×pcrbuffer-2.5μl；滅菌水-19.5μl。

7.tricine-sds-page

a.蛋白多肽粗提

(a)收取dmem緩沖培養基培養過夜之后的菌液100ml，10000rpm離心10min，分別收集菌體沉淀及上清液；

(b)菌體沉淀轉移至破壁管中，機械破壁，系數為4.0，時間為1min，重復6次，加入適量去離子水，10000rpm離心10min，除去沉淀，收集上清；

(c)用無菌蒸餾水清洗過濾膜組件3次，洗干凈保護液，流盡清洗液，將10kda中空纖維濾膜裝上，安裝好膜組件，再用pbs緩沖液沖洗組件3次；

(d)將離心后收集的上清液通過過濾膜組件，壓力為0.15mpa，溫度為37℃，時間為2h，得到的殘渣，用適量的無菌水溶解，重復過濾二次；

(e)取過濾液，加入固體硫酸銨至飽和度為40％，靜置30min，離心除去沉淀，離心后得到的上清液繼續加入固體硫酸銨至飽和度為60％，于0℃下靜放3h，12000rpm離心10min，棄去上清，收集沉淀物，

(f)使用0.1m的醋酸銨甲醇溶液清洗沉淀兩次，再用80％已預冷的的丙酮溶液潤洗三次，加入100％冷凍丙酮洗一次，低溫干燥30min，加入適量蒸餾水溶解干燥物，備用。

b.電泳

(a)先注入分離膠，待分離膠凝固45min后，再注入夾層膠，約45min待夾層膠凝固，最后加入濃縮膠，凝固45min；

(b)在電泳槽底部加入正極緩沖液，把制好的膠板同其制膠裝置一起放入電泳槽內，在膠層間加入負極緩沖液，將整個電泳裝置置于冰上，用60v的電壓先電泳30min；

(c)取少量分離得到的蛋白樣品，用樣品緩沖液稀釋至5ml，開始加樣電泳，當染料從夾層膠進入分離膠后，電壓加到120v，繼續電泳，直至染料到達分離膠頂端，停止電泳；

(d)取出電泳槽中的膠板，即刻置于固定液中浸泡固定1.5h，再將膠板取出，于45℃的染色液中浸泡1.5h，然后用無菌蒸餾水將膠板洗滌兩次，最后用變換脫色液，清洗多次，當看到明顯的條帶和清晰的背景則停止沖洗；

(e)洗脫后，用凝膠成像儀成像，觀察目的蛋白的表達，并拍照保存。

8.westernblotting

(1)制膠：配置12％的分離膠并注入玻璃板間隙至離上邊緣1.5cm處，上層加適量75％乙醇；待凝固，倒掉上層液體，注入5％濃縮膠，插入梳子，自然晾干。

(2)上樣：將蛋白質樣品100℃水浴3min，在電泳槽中倒入新配置的電泳液，分別在兩邊泳道加入8μl和5μl蛋白maker，用1×蛋白上樣緩沖液補足體積到10μl，其余泳道各加10μl樣品，50v恒壓跑電泳。

(3)轉膜：電泳結束后，剪取11cm×8cm濾紙和合適大小的0.22μm的pvdf膜，用甲醇活化5min，按照“海綿-6層濾紙-凝膠-pvdf膜-6層濾紙-海綿”組裝轉印夾層，夾板組裝后轉移至轉膜槽，200ma恒流轉移60min。

(4)孵育抗體：轉膜結束后，tbs液洗膜5min，5％的脫脂奶粉封閉1h，tbst液洗膜3次，每次5min，加一抗兔抗人sirt3多克隆抗體稀釋液4℃過夜孵育；tbst液洗膜3次，每次5min，加二抗兔抗稀釋液室溫孵育1h。

(5)發光檢測：tbst液洗膜，加發光液孵育3min，用濾紙吸干發光液，將膠片和pvdf膜放入壓片盒中壓片1min，取出膠片定影30s，用水清洗，烘干，掃描。

實驗結果：

1.菌體的生長情況的檢查結果見表1。

表1菌體生長情況檢查結果

2.16srdna鑒定結果

進入ncbi核酸數據庫http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，輸入待測菌株的16srdna序列，點擊blast進入比對。

比對結果顯示，有兩種菌株的16srdna序列與其它多株嗜酸乳桿菌的16srdna序列有98％的相似性，初步判斷為嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)，將其命名為lactobacillusacidophilusla15，lactobacillusacidophilusla17。

3.抑菌活性測定

抑菌活性的試驗結果，見表2，兩株嗜酸乳桿菌都有一定的抑菌能力。

表2l.acidophilus抑菌活性的試驗結果

4.藥敏試驗，結果見表3所示。篩選到的兩株嗜酸乳桿菌都具有很強的頭孢抗性。

表3l.acidophilus的藥敏試驗結果

注：s-敏感；r-耐藥；i-中度耐藥。

5.sir2基因pcr鑒定結果

如圖1所示，在720bp處分別擴增出二條嗜酸乳桿菌sir2基因條帶。

6.tricine-sds-page結果

如圖2所示，兩株嗜酸乳桿菌sir2蛋白分別在2.7kd處有一條明亮的條帶。

7.westernblotting

如圖3westernblot結果顯示，嗜酸乳桿菌中l.acidophilusla17的sir2蛋白表達量最高。因此，成功篩選到帶有頭孢抗性且高表達sir2蛋白的嗜酸乳桿菌l.acidophilusla17。

實施例2

本實施例通過嗜酸乳桿菌l.acidophilusla17(下稱la17)喂飼用d-半乳糖所致亞急性衰老小鼠為衰老動物模型，對小鼠各器官的指數和生化指標進行測定和比較，探討la17的作用。

1.動物分組

昆明種小鼠40只，雌雄各半，體重(20±2)g，暨南大學實驗動物中心提供。適應性飼養1w后，隨機分為四組，每組10只。第一組為空白對照組、第二組為模型對照組，第三組為嗜酸乳桿菌組。

2.藥品及試劑

la17為實施例1所得；d-半乳糖購至北京鼎國生物有限公司，sod、mda、gsh-px、no、nos試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

3.模型建立及給藥方案

模型對照組和給藥組小鼠每日接受頸背部皮下注射d-半乳糖0.15mg/g體重(生理鹽水配制)，對照組注射等量的生理鹽水；同時給藥組小鼠每日分別灌胃la17液(濃度到10¹⁰，每日灌胃給藥1ml)，空白對照組和模型對照組小鼠灌胃等量的生理鹽水，共40d。

4.檢測指標

各組動物經連續處理40d后稱重，斷頸處死，取出腦，胸腺、脾、肝、腎，用0.9％生理鹽水洗凈殘留血液后精確稱重，計算器官指數。用于切片的腦組織置于10％甲醛中固定，其余臟器組織用錫箔紙包好，置-80℃超低溫冰箱保存待用。

5.各臟器指數的測定

準確稱取小鼠全腦、胸腺、脾臟濕重后，計算各臟器指數(mg/g)〔胸腺重量(mg)/體重(g)〕。

6.腦組織中生化指標的測定

將凍存的腦組織放入組織勻漿機配用的玻璃管中，加入9倍體積預冷的生理鹽水(蒸餾水)，充分研磨后，制成10％腦組織勻漿。采用考馬斯亮藍法測定腦組織勻漿中總蛋白含量；硫代巴比妥酸反應物法測定mda含量；酶法檢測gsh-px的活性；硝酸還原法檢測no具體檢測方法參照試劑盒說明書。

7.統計學處理

所有數據均以x±s表示，多組間比較采用spss13.0統計學分析軟件進行單因素方差分析。

表4實驗組對衰老小鼠臟器指數的影響

表5實驗組對腦組織中生化指標的影響

結果：

1.la17對衰老小鼠臟器指數的影響(見表4)。與空白對照組比較，模型組小鼠腦、胸腺、脾，肝、腎指數均減小(p＜0.05)，實驗組小鼠各器官指數明顯升高。

組織器官的重量，特別是腦、胸腺、脾、肝、腎等重要器官的重量變化是反映生物體衰老程度的重要指標。免疫器官衰變最明顯的是胸腺和脾，胸腺和脾重量的降低、萎縮、功能衰退可使免疫功能降低，導致老年動物(人)惡性疾病發生率增高，加速老化進程。本結果顯示d-半乳糖誘導的亞急性衰老小腦、胸腺、脾臟、肝、腎指數均顯著下降，la17治療明顯提高了衰老小鼠腦、胸腺、脾臟、肝、腎重量，說明la17能夠有效對抗小鼠腦的衰老，保持機體的免疫功能，提高抗病能力，從而對延緩衰老和增強免疫力具有積極的意義。

2.la17對衰老小鼠組織sod、mad、gsh-px、no、nos的影響(見表5)。與空白對照組比較，模型組小鼠腦組織mad含量顯著提高，差異有統計學意(p＜0.01)，sod、gsh-px、no、nos活性明顯降低(p＜0.01)，差異在統計學意義(p＜0.01)。

生物體存在抗氧化系統，其中sod是最關鍵的酶之一。此酶能清除超氧陰離子自由基、保護細胞免受損傷，其活性高低間接反映了機體的抗氧化能力。美國巴樂的摩老年醫學研究中心研究證明，哺乳動物體內sod含量與其壽命之間呈明顯正相關關系。本實驗結果發現：la17能明顯增強d-半乳糖誘導衰老小鼠的腦組織sod活性，提高腦組織對自由基的清除能力，阻斷自由基應答。

自由基是機體正常代謝產生，但過多的自由基可侵犯細胞，特別是腦組織中的不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，形成代謝產物mda，繼而形成脂褐素，通過與蛋白質、核酸等生物大分子交聯，破壞正常細胞的功能。因此，mda含量常常可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映細胞的損傷程度，是老化的重要指標。

no由nos利用左旋精氨酸內源性合成，是具有廣泛的生物學作用的小分子物質，能溶于水和脂質，可通過旁分泌快速擴散至鄰近細胞，與細胞內鳥氨酸環化酶上的血紅素基因結合激活該酶，由鳥氨酸環化酶催化鳥氨酸生成環鳥營(cgmp)。cgmp作為第二信使，通過信號級聯放大作用，引起一系列生物學效應。no在神經系統中的主要作用為介導神經元對興奮性氨基酸的反應和增強機體的學習記憶能力等，其含量降低與衰老及許多老年性疾病如老年性癡呆、高血壓、動脈粥樣硬化等的發生有關。nos是no合成的限速酶，含有nos的神經元在中樞神經系統許多部位存在，包括大腦皮層、海馬、下丘腦等，no在這些部位的神經元活動調控中起重要作用。生理性衰老與腦組織內nos活性降低密切相關。nos活性降低，使腦中no含量下降，從而可導致巨噬細胞吞噬能力下降；使有活性的鳥昔酸環化酶含量降低，調節多種代謝的能力減弱，可進一走加速衰老。本實驗結果顯示：模型衰老小鼠的nos活性和no含量顯著下降，la17能明顯提高衰老模型小鼠的nos活性和no含量。上述結果提示la17能通過增強nos活性，使no生成量增多，其生物學效應能持久發揮，從而可延緩機體衰老。

gsh-px是廣泛存在于機體內的一種重要的催化過氧化分解的酶，它特異性地催化gsh對過氧化氫的還原反應，抑制煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)形成oh-，削弱對脂質過氧化作用的損傷，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。本實驗結果表明la17可顯著提高d-半乳糖致衰老小鼠腦組gsh-px活性，提高體內抗氧化酶活性，減輕自由基對生物大分子的傷害，而起到延緩衰老的作用。

綜上，本實驗表明嗜酸乳桿菌能提高sod、gsh-px、no和nos的水平，降低mda的含量，提示嗜酸乳桿菌可能是通過提高機體抗氧化能力，清除衰老機體產生過多的自由基，抑制機體、組織、細胞的過氧化過程，而起到延緩衰老作用。

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