一種萊鮑迪苷KA的制備方法與流程

本發明屬于天然產物生物合成和食品化工
技術領域：
，具體涉及糖基轉移酶催化甜茶苷生物合成天然非糖類甜味劑萊鮑迪苷ka。
背景技術：
：高熱量食品和飲料過量攝取引起的肥胖、糖尿病和高血脂及其相關代謝疾病已成為困擾國際社會的重大健康難題，低(無)熱量、非糖類甜味劑的研發越來越受重視。目前全球廣泛使用的非糖類甜味劑數量較少，根據來源可分為兩類：第一類為天然甜味劑，是指從自然界生物體中提取而得的產品如甜菊苷、羅漢果苷、甜茶苷、甘草甜素等。第二類為化學合成甜味劑，是指化學合成的一類具有甜味的化合物，如阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精鈉、甜蜜素等(weihrauchm.r.etal.annoncol,2004,15:1460-1465)。化學合成甜味劑可能對人體有致癌、致畸、致病等副作用，所以，近年來很多國家對化學合成甜味劑采取了嚴格管控措施，嚴禁在嬰幼兒食品和飲料中添加。在此背景下，低或無熱量、安全綠色的天然甜味劑受到了消費者的廣泛接受和歡迎，成為人類理想的食品、飲料、藥品、營養保健品、酒類等的添加劑(carakostasm.c.etal.foodchemtoxicol,2008,46:s1-s10；lemus-mondacar.etal.foodchem,2012,132:1121-1132.)。甜茶苷又名甜茶素(rubusoside，如圖所示)是薔薇科植物甜茶(rubussuavissmuss,lee)產的一種四環二萜苷化合物，分子式c32h50o13，甜度為蔗糖的300倍，熱值不足蔗糖的1％(何偉平.廣西輕工業,1999,1:1-5.)。甜茶苷對熱和酸穩定，食用后不會導致齲齒、心血管、肥胖、糖尿病等疾病，是一種高甜度、低熱能和具有保健功能的天然甜味劑，已被應用于食品、飲料和保健品等領域(司佳,等.食品科技,2013,38:262-266)。但是，甜味不純、具有后滯苦味是甜茶苷的最大缺點，限制了其廣泛應用。2014年ibrahimma等首次從甜葉菊中分離純化和結構表征了甜菊苷的同分異構體萊鮑迪苷ka(rebaudiosideka，如圖所示)，其分子式為c38h59o18，甜度為蔗糖的數百倍，熱值不足蔗糖的1％，甜味純正且無后滯苦味，是一種理想的天然甜味劑。但是，由于萊鮑迪苷ka在甜葉菊中的含量極低，難以通過分離純化法大量制備，且目前無法采用合成生物學策略或化學方法合成(ibrahimm.a.etal.jnatprod,2014,77:1231-1235)。因此，受到可獲得性的限制，目前萊鮑迪苷ka尚未被作為甜味劑添加使用，但根據其甜度及性質將可作為添加劑用于食品(如糖果、巧克力、蜜餞、糖制糕點、蛋糕、腌漬品、健康食品等)、飲料(可樂、咖啡、果汁、涼茶、罐頭、碳酸飲料、功能飲料、營養飲料、能量飲料、茶飲料、含氣低酒精飲料等)、藥品(藥品的矯味劑、甜味劑等)、酒類(紅酒、米酒、黃酒、水果酒、冰酒等)、營養保健品(酵素、蜂蜜、奶制品、葉酸制品、膳食纖維制品、維生素制品、蛋白質粉制品、補鈣制品、膠原蛋白粉制品、魚油制品、微量元素制品、補血劑等)、調味品(果醬、甜醋、料酒、飴糖、蜜餞果脯等)、日用化工品(果膠、香皂、香煙等)、口腔衛生產品(口香糖、牙膏、涑口水等)或化妝品。糖基轉移酶是催化單糖基團從糖基供體向受體底物轉移并形成糖苷鍵的一類酶，屬于化合物糖基化修飾的主要酶類。根據糖基供體不同，糖基轉移酶可分為ndp-糖(如ndp-葡萄糖、ndp-半乳糖、ndp-麥芽糖、ndp-葡萄糖醛酸等)依賴的leloirgts和非ndp-糖(可溶性淀粉、蔗糖或糊精等)依賴的non-leloirgts兩種類型(bretonc.etal.curropinstrucbiol,1999,9:563-571.)。與化學糖基化修飾方法相比，糖基轉移酶催化的糖基化修飾反應具有更強的位點選擇性和立體選擇性。因此，目前糖基轉移酶已被廣泛應用于改善藥物分子水溶性、提高生物活性(weiw.etal.molplant,2015,8:1412-1424.)以及甜味劑口味改進和增加甜度等方面(danielib.etal.helvchimacta,1997,80:1153-1160.)。鑒于萊鮑迪苷ka僅在19位比甜茶苷多一個以β-1，2-糖苷鍵連接的葡萄糖基的結構特征和糖基轉移酶可以催化糖基化修飾的優勢，荷蘭帝斯曼集團(dsm)和美國conagen公司近期分別利用udp-葡萄糖依賴的糖基轉移酶hv1、eugt11、ugt76g1等(wo2016151046、wo2016146711、wo2016168413、us20160153018)采用甜茶苷葡萄糖基修飾而開發了萊鮑迪苷ka的生物合成技術。但是，由于前述專利中所用的糖基轉移酶的底物選擇性不強，在生成萊鮑迪苷ka的同時，進一步催化萊鮑迪苷ka葡萄糖基修飾生成萊鮑迪苷e，反應過程也無法控制，所以最終產物為萊鮑迪苷ka和e的混合物。同時，二個產物結構類似，分離難度大，成本高，不適合工業化應用。技術實現要素：本發明的目的在于采用底物專一性強的糖基轉移酶建立一種綠色、專一、經濟的天然甜味劑萊鮑迪苷ka的生物合成新方法，大量獲得純度大于95％的萊鮑迪苷ka。為實現上述目的，本發明所采用的技術方案具體如下：一種萊鮑迪苷ka的制備方法，以udp-葡萄糖為活性糖供體，使用udp-g依賴型糖基轉移酶oled或者與oled氨基酸序列同源性大于或等于69.5％的酶或蛋白質定點糖基化修飾甜茶苷，制備得到萊鮑迪苷ka，所述糖基轉移酶oled為來源自streptomycesantibioticus的udp-g依賴型糖基轉移酶，優選udp-g依賴型糖基轉移酶oled的氨基酸序列如seqidno:1所示。本發明所述同源性大于或等于69.5％的酶或蛋白質如hxsw-gt-09(氨基酸序列如seqidno:2所示)、hxsw-gt-10(氨基酸序列如seqidno:3所示)和hxsw-gt-11(氨基酸序列如seqidno:4所示)。hxsw-gt-09、hxsw-gt-10和hxsw-gt-11為基于序列、結構和催化機制改造所獲得的oled突變體。本發明所述的制備方法，合成oled及其同源蛋白基因后，利用相應的表達載體構建大腸桿菌工程菌株、酵母菌工程菌株、枯草芽孢桿菌表達菌株、乳酸菌表達菌株、鏈霉菌表達菌株，用于糖基轉移酶的重組表達。本發明所述的制備方法，可以以udp-葡萄糖、蔗糖-蔗糖合成酶-udp-葡萄糖再生循環系統或細菌內源性udp-葡萄糖生物合成體系或設計改造后的udp-葡萄糖生物合成體系(maoz.c.etal,biotechnolprog,2006,22:369-374；ohj.s.etal.ksbbj,2008,23:474-478；rodríguezdíazj.etal.j.biotechnol,2011,154:212-215；ruffinga.etal.mirobcellfact,2006,5:25；yany.etal.biotechnolbioeng,2008,100:126-140)作為活性糖供體的來源。即可以向反應體系加入外源性udp-葡萄糖，也可以由蔗糖-蔗糖合成酶-udp-葡萄糖再生循環系統或內源性udp-葡萄糖合成途徑產生。本發明以催化甜茶苷的糖基化修飾定義oled及其同源蛋白的酶活力。在相同的反應體系條件下，考察oled及其同源蛋白催化甜茶苷定點葡萄糖基修飾制備萊鮑迪苷ka的效率。本發明所述的制備方法，可以以游離的oled及其同源蛋白、固定化oled及其同源蛋白或表達oled及其同源蛋白的細菌細胞作為生物催化劑，催化萊鮑迪苷ka的生物合成。進一步的，本發明所述方法可用含糖基轉移酶的細胞提取液構建反應體系；或用含糖基轉移酶的菌體構建原位或靜息細胞反應體系；或用固定化酶構建催化體系。本發明所述的一個優選的方案，反應的ph為6.0-14.0，優選11.0；反應的溫度為15-40℃，優選30℃；甜茶苷和udp-葡萄糖的摩爾濃度比值為1:0.5-1:10，優選1:6；反應時間為2-72小時，優選16小時。本發明所述的一個優選的方案，在酶活力0.5u/ml條件下，底物甜茶苷的濃度為1-100mg/ml，優選15mg/ml，最佳底物濃度(mg/ml)和酶活力(u/ml)比值為2：1～50：1。本發明的另一目的在于提供一類與oled同源性超過69.5％的同源蛋白質，所述蛋白質氨基酸序列如seqidno:2-4所示。萊鮑迪苷ka的甜度為蔗糖300倍左右，且口味純正無后滯苦味，熱量不足蔗糖的1％。萊鮑迪苷ka可溶于水和乙醇水溶液，可作為甜味劑或矯味劑添加至食品(如糖果、巧克力、蜜餞、糖制糕點、蛋糕、腌漬品、健康食品等)、飲料(可樂、咖啡、果汁、涼茶、罐頭、碳酸飲料、功能飲料、營養飲料、能量飲料、茶飲料、含氣低酒精飲料等)、藥品(藥品的矯味劑、甜味劑等)、酒類(紅酒、米酒、黃酒、水果酒、冰酒等)、營養保健品(酵素、蜂蜜、奶制品、葉酸制品、膳食纖維制品、維生素制品、蛋白質粉制品、補鈣制品、膠原蛋白粉制品、魚油制品、微量元素制品、補血劑等)、調味品(果醬、甜醋、料酒、飴糖、蜜餞果脯等)、日用化工品(果膠、香皂、香煙等)、口腔衛生產品(口香糖、牙膏、涑口水等)或化妝品。本發明具有如下優點：oled一種是來源自鏈霉菌streptomycesantibioticus的udp-葡萄糖依賴的糖基轉移酶，在體內的天然底物是竹桃霉素、紅霉素和泰樂菌素，能夠將葡萄糖從udp-葡萄糖上定點轉移至上述大環內酯類抗生素去氧糖胺結構的2-oh，形成β-1，2-糖苷鍵(quiroslm,etal.jbiolchem,1995，27:18234-18239.)。因此，為避免dsm和conagen上述專利技術存在多種產物的缺陷，本發明采用底物專一性強的udp-葡萄糖依賴型糖基轉移酶oled及其同源蛋白定點葡萄糖基修飾甜茶苷以制備單一的萊鮑迪苷ka，無副產物，反應條件簡單易控，便于產物純化及工業化放大。綜上所述，萊鮑迪苷ka性質優異，安全性好，潛在應用價值巨大，市場前景廣闊。利用糖基轉移酶定點糖基化修飾甜茶苷獲得萊鮑迪苷ka的方法綠色，先進，易于工業化。附圖說明圖1為oled及其同源蛋白hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12合成萊鮑迪苷ka的hplc圖譜。圖2為萊鮑迪苷ka的1h-nmr圖譜。圖3為萊鮑迪苷ka的13c-nmr圖譜。圖4為萊鮑迪苷ka的dept圖譜。圖5為萊鮑迪苷ka的hmbc圖譜。圖6為萊鮑迪苷ka的hmqc圖譜。圖7為萊鮑迪苷ka的nosey圖譜。具體實施方式以下進一步提供實施實例，這些實施實例有助于理解本發明，僅用作說明而不限制本發明的應用范圍。實施例1糖基轉移酶在大腸桿菌中重組表達設計oled同源蛋白：hxsw-gt-09和hxsw-gt-10是基于oled結構和催化機制選擇多個關鍵氨基酸殘基突變所獲得；hxsw-gt-11和hxsw-gt-12是基于多重序列比對和oled結構進行關鍵氨基酸殘基突變和udp-葡萄糖或底物結合相關部位的motif重組所獲得。hxsw-gt-09(氨基酸序列如seqidno:2所示，核苷酸序列如seqidno:7所示)、hxsw-gt-10(氨基酸序列如seqidno:3所示，核苷酸序列如seqidno:8所示)、hxsw-gt-11(氨基酸序列如seqidno:4所示，核苷酸序列如seqidno:9所示)、hxsw-gt-12(氨基酸序列如seqidno:5所示，核苷酸序列如seqidno:10所示)。將糖基轉移酶oled(氨基酸序列如seqidno:1所示，核苷酸序列如seqidno:6所示)及上述oled同源蛋白的基因委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成并分別利用pet22b(+)構建表達質粒pet22b-oled、pet22b-hxsw-gt09、pet22b-hxsw-gt10、pet22b-hxsw-gt11、pet22b-hxsw-gt12。將上述重組表達質粒分別轉入e.colibl21表達宿主，得到5種e.coli工程菌株，分別命名為poled、pgt-09、pgt-10、pgt-11和pgt-12。將5株e.coli工程菌分別接種至50ml的lb培養基(含100μg/ml氨芐青霉素)，37℃、220rpm振搖過夜培養獲得相應種子液。將種子液按5％接種量轉接至lb培養基(含100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃振搖培養至od600＝0.8±0.1時，加入誘導劑iptg使其終濃度為0.4mm，在16℃條件下，誘導培養12小時，即實現糖基轉移酶的異源表達。sds-page分析poled、pgt-09、pgt-10、pgt-11和pgt-12工程菌中的糖基轉移酶可溶性表達情況，結果如表1所示。結果顯示，糖基轉移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12均能可溶性表達，含量分別占總可溶蛋白的20％、22％、18％、7％和23％。表1糖基轉移酶種類和信息實施例2糖基轉移酶在酵母菌中重組表達將糖基轉移酶oled及其同源蛋白基因分別構建至畢赤酵母蛋白表達載體ppic9k，然后將重組表達質粒電擊轉化至畢赤酵母gs115，按照invitrogen公司畢赤酵母操作手冊篩選陽性轉化子(g418抗性篩選)。挑選單克隆接種于lb培養基，30℃過夜培養獲得菌液，按1％接種量(v/v)接至bmgy培養基，30℃、250rpm培養48h，離心收集菌體，然后菌體重懸并轉接至bmmy中，30℃、250rpm條件下甲醇誘導表達5天。誘導表達完成后sds-page分析培養基上清液中目標蛋白的表達情況，篩選相應的陽性菌株，再從培養基ph值、誘導溫度以及甲醇濃度三個方面初步優化表達條件。結果顯示，糖基轉移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12在畢赤酵母gs115中的表達量分別為0.28μg/ml、0.27μg/ml、0.21μg/ml、0.23μg/ml、0.25μg/ml，驗證了糖基轉移酶在酵母菌中表達的可行性。實施例3糖基轉移酶在枯草芽孢桿菌中重組表達將糖基轉移酶oled及其同源蛋白基因分別構建至枯草芽孢桿菌分泌表達載體pht43，化學法將重組表達質粒轉化至枯草芽孢桿菌wb800，在含有氨芐青霉素的lb固體培養基上篩選陽性克隆。挑取陽性菌落接種至含氨芐青霉素的lb液體培養基中，37℃培養至od600＝0.5時，加入iptg誘導過夜，離心獲得培養基上清，sds-page分析上清液中目標蛋白的表達情況。結果顯示，糖基轉移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12在枯草芽孢桿菌wb800中的分泌表達量高于酵母菌，分別為為0.33μg/ml、0.31μg/ml、0.27μg/ml、0.25μg/ml、0.28μg/ml，驗證了糖基轉移酶在枯草芽孢桿菌中表達的可行性。實施例4糖基轉移酶在乳酸菌中重組表達將糖基轉移酶oled及其同源蛋白基因分別構建至乳酸菌食品級表達載體pnz8148，將重組表達質粒電轉至乳酸菌nz9000，在含氯霉素的gm17培養基中篩選陽性菌株。將陽性菌株接種至新鮮gm17培養基培養至od600＝0.6時，加入乳酸鏈球菌肽誘導，sds-page分析目標蛋白的表達情況。結果顯示，糖基轉移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12在乳酸菌wb800中的表達量高于枯草芽孢桿菌，分別為為0.54μg/ml、0.57μg/ml、0.42μg/ml、0.19μg/ml、0.38μg/ml，驗證了糖基轉移酶在乳酸菌中表達的可行性。實施例5糖基轉移酶在鏈霉菌中重組表達將糖基轉移酶oled及其同源蛋白基因分別構建至鏈霉菌游離表達質粒載體pwhm7，通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間結合轉移的方法轉化至變鉛青鏈霉菌tk24(s.lividanstk24)，篩選陽性菌株后，發酵培養，通過測定s.lividanstk24轉化子催化甜茶苷的糖基化修飾來評價糖基轉移酶基因的表達水平(產物的hplc分析方法見實施例6)。結果顯示，糖基轉移酶oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10和hxsw-gt-11能夠催化甜茶苷糖基化，產物的產率分別為53.1％、50.7％、5.8％、11.5％，而hxsw-gt-12無催化功能，驗證了糖基轉移酶在鏈霉菌中表達的可行性。實施例6糖基轉移酶催化甜茶苷的糖基化鑒于糖基轉移酶大腸桿菌表達的經濟性、簡便性和高效性，故本發明優選大腸桿菌表達系統進行后續的甜茶苷糖基化修飾條件考察。1ml反應體系中，底物甜茶苷為0.3mm，udp-葡萄糖為1.2mm，0.05mtris-hcl緩沖液(ph8.0)，糖基轉移酶粗酶液500μl，25℃振搖反應12小時。反應結束后，加熱除蛋白，再加入兩倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析。以每毫升酶液每小時催化50μm底物甜茶苷消失的量定義為1u酶活力。oled、hxsw-gt-09、hxsw-gt-10、hxsw-gt-11和hxsw-gt-12的活力分別是1.0u/ml、1.0u/ml、0.2u/ml、0.4u/ml和0u/ml。hplc檢測條件：色譜柱：agilentc18,5μm,150×4.6mm；流動相：a：超純水(含0.1％甲酸)；b：乙腈(含0.1％甲酸)；分析時間：25min，進樣量：20μl，柱溫：35℃，檢測波長：220nm；流速：0.8ml/min，梯度洗脫：10％b-95％b。在上述hplc分析條件下，甜茶苷的保留時間為13.9min，產物為11.5min，結果如圖1所示。產物經制備高效液相制備后獲得純度98.5％的白色固體樣品10mg，nmr圖譜解析后確證產物即為萊鮑迪苷ka(如圖2-7)。根據面積歸一化法，計算糖基轉移酶催化合成萊鮑迪苷ka的效率，結果如表2所示。oled、hxsw-gt-09催化效率相當，hxsw-gt-12無催化功能，故在后續的反應條件考察中選擇oled和hxsw-gt-09作為考察對象。表2糖基轉移酶催化合成萊鮑迪苷ka的效率糖基轉移酶與oled的氨基酸序列同源性萊鮑迪苷ka產率oled100％99.6％hxsw-gt-0998.3％99.5％hxsw-gt-1089.5％18.2％hxsw-gt-1169.5％23.8％hxsw-gt-1258.2％0實施例7靜息細胞催化甜茶苷糖基化1ml反應體系中，底物甜茶苷為1mm，udp-葡萄糖為4mm或不添加外源性udp-葡萄糖，0.05mtris-hcl緩沖液(ph8.0)，含糖基轉移酶的靜息細胞重懸液(酶活力為0.5u)，25℃振搖反應12小時。反應結束后，加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析，分析方法見實施例6。結果如表3所示。表3靜息細胞催化合成萊鮑迪苷ka的效率糖基轉移酶是否外加udp-葡萄糖萊鮑迪苷ka產率oled是86.3％oled否38.6％hxsw-gt-09是84.9％hxsw-gt-09否36.1％實施例8原位生物轉化50ml的原位體系中，底物甜茶苷為1mm，udp-葡萄糖為4mm或不添加外源性udp-葡萄糖，調節發酵液ph至8.0，25℃振搖反應12小時。反應結束后，加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析，分析方法見實施例6。結果如表4所示。表4萊鮑迪苷ka的原位生物合成原位轉化菌株外加udp-葡萄糖萊鮑迪苷ka產率poled是44.7％poled否21.9％pgt-09是45.4％pgt-09否19.8％實施例9固定化酶催化合成萊鮑迪苷ka分別采用殼聚糖和明膠按照常規固定化酶制備方法制備固定化oled和固定化hxsw-gt-09用于催化合成萊鮑迪苷ka。1ml反應體系中，底物甜茶苷為1mm，udp-葡萄糖為4mm，0.05mtris-hcl緩沖液(ph8.0)，0.5u的固定化糖基轉移酶，25℃振搖反應12小時。反應結束后，過濾除去固定化酶，濾液再用2倍體積甲醇處理后，離心進行hplc分析，分析方法見實施例6。結果顯示，固定化oled和固定化hxsw-gt-09催化合成萊鮑迪苷ka的產率分別是87.8％和84.9％。實施例10蔗糖-udp-葡萄糖再生循環系統i采用蔗糖、蔗糖合成酶以及udp組成udp-葡萄糖再生體系用于糖基轉移酶制備萊鮑迪苷ka。5ml反應體系中，底物甜茶苷為1mm，udp為4mm，2.5u的糖基轉移酶，蔗糖0.1m，蔗糖合成酶粗酶液2.5ml，反應體系的ph為8.0，25℃振搖反應12小時。反應結束后，煮沸離心除蛋白，再用兩倍體積的甲醇處理后，離心進行hplc分析，分析方法見實施例6。結果如表5所示。表5萊鮑迪苷ka的合成效率糖基轉移酶蔗糖合成酶來源萊鮑迪苷ka產率oledarabidopsisthaliana86.7％oledvignaradiate83.8％hxsw-gt-09arabidopsisthaliana84.4％hxsw-gt-09vignaradiate82.5％實施例11蔗糖-udp-葡萄糖再生循環系統ii利用petduet-1共表達載體構建糖基轉移酶和蔗糖合成酶的共表達質粒，并獲得相應共表達菌株po-ats、po-vrs、pgt9-ats、pgt9-vrs。共表達程序與實施例1相同，表達條件為0.5mmiptg，20℃、12小時。表達完成后利用50ml菌液構建原位轉化體系：底物甜茶苷為1mm，udp為4mm，蔗糖0.1m，反應體系的ph調節至8.0，25℃振搖反應12小時。反應結束后，hplc分析萊鮑迪苷ka的合成情況，分析方法見實施例6。結果如表6所示。表6萊鮑迪苷ka的合成效率實施例12蔗糖-udp-葡萄糖再生循環系統iiipo-ats、po-vrs、pgt9-ats、pgt9-vrs按照實施例8的條件表達完成后，收集菌體，然后將菌體按照1:10比例用0.05mtris-hcl(ph8.0)的緩沖液稀釋，構建靜息細胞反應體系：底物甜茶苷為1mm，udp為4mm，蔗糖0.1m，25℃振搖反應12小時。反應結束后，hplc分析萊鮑迪苷ka的合成情況，分析方法見實施例6。結果如表7所示。表7萊鮑迪苷ka的合成效率實施例13內源性udp-葡萄糖合成系統利用pacycduet-1載體將udp-葡萄糖合成途徑中兩個關鍵酶葡萄糖磷酸變位酶(pgm)和udp-葡萄糖焦磷酸化酶(galu)一并導入工程菌株poled和pgt-09，獲得內源性udp-葡萄糖合成途徑改造的大腸桿菌菌株poled-p-g和pgt-09-p-g。誘導表達條件與實施例8相同。表達完成后利用50ml菌液構建原位轉化體系：底物甜茶苷為1mm，葡萄糖0.05m，反應體系的ph調節至8.0，25℃振搖反應12小時。反應結束后，hplc分析萊鮑迪苷ka的合成情況，分析方法見實施例6。結果如表8所示。表8萊鮑迪苷ka的合成效率實施例14最佳反應ph值鑒于oled催化甜茶苷糖基化的活性強于hxsw-gt-09，所以針對oled進行反應條件優化。考察最佳反應ph值(5ml)：底物甜茶苷為23.4mm(15mg/ml)，udp-葡萄糖為93.6mm，反應ph值為6.0～14.0，2.5uoled粗酶液，25℃振搖反應12小時。反應結束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析，分析方法見實施例6。不同ph條件下的萊鮑迪苷ka產率如表9所示。根據結果，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳ph為11.0。表9不同ph條件下的萊鮑迪苷ka產率反應ph6.07.08.09.010.011.012.013.014.0產率2.57％14.89％27.62％34.71％47.31％63.26％58.81％23.27％7.18％實施例15最佳反應溫度考察最佳反應溫度(5ml)：底物甜茶苷為23.4mm(15mg/ml)，udp-葡萄糖為93.6mm，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于15～40℃振搖反應12小時。反應結束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析，分析方法見實施例6。不同反應溫度下的萊鮑迪苷ka產率如表10所示。根據結果，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳溫度為30℃。表10不同反應溫度下的萊鮑迪苷ka產率反應溫度15℃25℃30℃35℃40℃產率49.16％63.26％73.71％70.54％66.82％實施例16最佳udp-葡萄糖用量考察最佳udp-葡萄糖用量(5ml)：底物甜茶苷為23.4mm(15mg/ml)，udp-葡萄糖為11.7-234mm，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于30℃振搖反應12小時。反應結束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析，分析方法見實施例6。不同udp-葡萄糖(udpg)用量的萊鮑迪苷ka產率如表11所示。根據結果，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳udp-葡萄糖用量為140.4mm，其與底物的最佳摩爾濃度比例為6:1。表11不同udp-葡萄糖(udpg)用量的萊鮑迪苷ka產率實施例17最佳底物濃度和酶用量考察最佳底物濃度(5ml)：底物甜茶苷為1mg/ml-100mg/ml，udp-葡萄糖為底物摩爾濃度的6倍，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于30℃振搖反應16小時。反應結束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析，分析方法見實施例6。不同甜茶苷濃度條件的萊鮑迪苷ka產率如表12所示。根據結果并結合能量損耗等因素，oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳底物濃度(mg/ml)和酶活力(u/ml)比值為30：1。表12不同甜茶苷濃度條件的萊鮑迪苷ka產率實施例18最佳反應時間考察最佳反應時間(5ml)：底物甜茶苷為15mg/ml，udp-葡萄糖為140.4mm，ph值為11.0，2.5uoled粗酶液，分別于30℃振搖反應4-72小時。反應結束后，加熱除蛋白，再加入2倍體積甲醇處理，離心過濾獲得的濾液進行hplc分析，分析方法見實施例6。不同反應時間的萊鮑迪苷ka產率如表13所示。根據結果并結合能量損耗等因素，將oled催化甜茶苷糖基化制備萊鮑迪苷ka的最佳反應時間定為16小時。表13不同反應時間的萊鮑迪苷ka產率反應時間4hrs8hrs12hrs16hrs24hrs36hrs48hrs72hrs產率73.41％83.22％90.72％96.87％96.93％97.01％97.31％97.11％sequencelisting<110>中國藥科大學<120>一種萊鮑迪苷ka的制備方法<130><160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>415<212>prt<213>人工序列<400>1metthrthrglnthrthrproalahisilealametpheserilealaalahisglyhisvalasnproserleugluvalilearggluleuvalalaargglyhisargvalthrtyralaileproprovalphealaasplysvalalaalathrglyalaargprovalleutyrhisserthrleuproglyproaspalaaspproglualatrpglyserthrleuleuaspasnvalglupropheleuasnaspalaileglnalaleuproglnleualaaspalatyralaaspaspileproaspleuvalleuhisaspilethrsertyrproalaargvalleualaargargtrpglyvalproalavalserleuserproasnleuvalalatrplysglytyrgluglugluvalalaglupromettrparggluproargglnthrgluargglyargalatyrtyralaargpheglualatrpleulysgluasnglyilethrgluhisproaspthrphealaserhisproproargserleuvalleuileprolysalaleuglnprohisalaaspargvalaspgluaspvaltyrthrphevalglyalacysglnglyaspargalaglugluglyglytrpglnargproalaglyalaglulysvalvalleuvalserleuglyseralaphethrlysglnproalaphetyrargglucysvalargalapheglyasnleuproglytrphisleuvalleuglnileglyarglysvalthrproalagluleuglygluleuproaspasnvalgluvalhisasptrpvalproglnleualaileleuargglnalaaspleuphevalthrhisalaglyalaglyglyserglngluglyleualathralathrprometilealavalproglnalavalaspglnpheglyasnalaaspmetleuglnglyleuglyvalalaarglysleualathrgluglualathralaaspleuleuarggluthralaleualaleuvalaspaspprogluvalalaargargleuargargileglnalaglumetalaglngluglyglythrargargalaalaaspleuileglualagluleuproalaarghisgluargglngluprovalglyaspargproasnglygly<210>2<211>418<212>prt<213>人工序列<400>2methisthrthrglnthrthrproalahisilealametpheserilealaalahisglyhisvalasnproserleugluvalilearggluleuvalalaargglyhisargvalthrtyralaileproprovalphealaasplysvalalaalathrglyalaargprovalleutyrhisserthrleuproglythraspalaaspproglualatrpglyserthrleuleuaspasnvalglupropheleuasnaspalaileglnalaleuproglnleualaaspalatyralaaspaspileproaspleuvalleuhisaspilethrsertyrproalaargvalleualaargargtrpglyvalproalavalserleupheproasnleuvalalatrplysglytyrgluglugluvalalaglupromettrparggluproargglnthrgluargglyargalatyrtyralaargpheglualatrpleulysgluasnglyilethrgluhisproaspthrphealaserhisproproargserleuvalleuileprolysalaleuglnprohisalaaspargvalaspgluaspvaltyrthrphevalglyalacysglnglyaspalaalaglugluglyglytrpglnargproalaglyalaglulysvalvalleuvalserleuglyservalphethrlysglnproalaphetyrargglucysvalargalapheglyasnleuproglytrphisleuvalleuglnileglyarglysvalthrproalagluleuglygluleuproaspasnvalgluvalhisasptrpvalproglnleualaileleuargglnalaaspleuphevalthrhisalaglyalaglyglyserglngluglyleualathralathrprometilealavalproglnalavalaspglnpheglyasnalaaspmetleuglnglyleuglyvalalaarglysleualathrgluglualathralaaspleuleuarggluthralaleualaleuvalaspaspprogluvalalaargargleuargargileglnalaglumetalaglngluglyglythrargargalaalaaspleuileglualagluleuproalaarghisgluargglngluprovalglyaspargproasnglyglyhisgly<210>3<211>408<212>prt<213>人工序列<400>3metthrsergluhisargseralaservalthrproalahisilealametpheserilealaalahisglyhisvalasnproserleugluvalilearggluleuvalalaargglyhisargvalthrtyralaileproprovalphealaasplysvalalaalathrglyalaargprovalleutyrhisserthrleuprolysproserasnprogluglusertrpprogluaspglngluseralametglyleupheleuasnaspalaileglnalaleuproglnleualaaspalatyralaaspaspileproaspleuvalleuhisaspilethrsertyrproalaargvalleualaargargtrpglyvalproalavalserleuserproasnleuvalalatrplysglytyrgluglugluvalalaglupromettrparggluproargglnthrgluargglyargalatyrtyralaargpheglualatrpleulysgluasnglyilethrgluhisproaspthrphealaserhisproproargserleuvalleuileprolysalaleuglnprohisalaaspargvalaspgluaspvaltyrthrphevalglyalacysglnglyaspargalaglugluglyglytrpglnargproalaglyalaglulysvalvalleuvalserleuglyseralaphethrlysglnproalaphetyrargglucysvalargalapheglyasnleuproglytrphisleuvalleuglnileglyarglysvalthrproalagluleuglygluleuproproasnvalgluvalhisglntrpvalproglnleuaspileleuthrlysalaseralapheilethrhisalaglymetglyserthrmetglualaleuserasnalavalprometilealavalproglnalavalaspglnpheglyasnalaaspmetleuglnglyleuglyvalalaarglysleualathrgluglualathralaaspleuleuarggluthralaleualaleuvalaspaspprogluvalalaargargleuargargileglnalaglumetalaglngluglyglythrargargalaalaaspleuileglualagluleuproalaarghisgly<210>4<211>470<212>prt<213>人工序列<400>4metlysarglysgluleuhisglu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